ALA介導(dǎo)的光動力療法誘導(dǎo)皮膚癌A375細(xì)胞與A431細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　研究5-α氨基酮戊酸（ALA）介導(dǎo)的光動力療法（ALA-PDT）對皮膚癌A375細(xì)胞與A431細(xì)胞的殺傷作用及其誘導(dǎo)其凋亡機(jī)制，為ALA-PDT應(yīng)用于臨床提供治療參數(shù)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　以皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞與鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞為研究對象；
　　1.研究ALA-PDT對皮膚癌細(xì)胞的殺傷作用，A375細(xì)胞與A431細(xì)胞與不同的ALA濃度孵育，在PDT作用后不同的時(shí)間，用噻唑藍(lán)法（MTT

2、）法檢測其增殖抑制率。
　　2.研究ALA-PDT誘導(dǎo)A375細(xì)胞與A431細(xì)胞發(fā)生凋亡機(jī)制。首先用TUNEL染色法分析ALA-PDT作用后A375細(xì)胞與A431細(xì)胞的凋亡率；接著，用Western-blot方法檢測ALA-PDT后兩株細(xì)胞凋亡過程中，外源性凋亡途徑相關(guān)蛋白Caspase8，線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax與Caspase9以及Caspase3與PARP的表達(dá)情況；最后，用免疫組化法檢測A375細(xì)胞與A43

3、1細(xì)胞在ALA-PDT作用前后細(xì)胞色素c（Cyt-c）在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，旨在從內(nèi)源性與外源性途徑揭示ALA-PDT誘發(fā)皮膚癌細(xì)胞凋亡機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.MTT比色法結(jié)果顯示不同濃度的ALA-PDT組對A375細(xì)胞與A431細(xì)胞均有殺傷作用，并與ALA藥物濃度和ALA-PDT作用后的時(shí)間密切相關(guān)，在0.4mmol/L ALA-PDT作用后4h，對A375細(xì)胞的增殖抑制作用達(dá)到最大程度；在0.6mmol/L ALA-P

4、DT作用后8h，對A431細(xì)胞的增殖抑制作用達(dá)到最大程度，趨于平衡。
　　2.TUNEL染色結(jié)果顯示ALA-PDT作用后陽性反應(yīng)在細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮區(qū)出現(xiàn)棕黃色沉淀反應(yīng)，即細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈時(shí)間依賴性增加。A375細(xì)胞在ALA-PDT作用后0.5h，1h，2h，4h與6h的凋亡率分別是11.79％，44.84%，63.75%，75.33%與90%。A431細(xì)胞在ALA-PDT作用后1h，2h，4h，6h與8h的凋亡率分別是10%，2

5、5%，55.5%，61.54%與70%。
　　3.Western blot的檢測結(jié)果顯示ALA-PDT作用激活了A375細(xì)胞與A431細(xì)胞的外源性凋亡途徑和線粒體凋亡途徑，啟動了Bcl-2家族及Caspase家族參與凋亡過程。隨著ALA-PDT作用后孵育時(shí)間的延長，抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，促凋亡蛋白Bax上調(diào);出現(xiàn)Caspase蛋白的級聯(lián)反應(yīng)及剪切。A375細(xì)胞在ALA-PDT作用后0.5h，1h與2h出現(xiàn)Caspase3，8與

6、9剪切體且上調(diào)；但是在ALA-PDT作用后4h與6h上述剪切體下調(diào)。A431細(xì)胞在ALA-PDT作用后1h，2h與4h出現(xiàn)上述剪切體且上調(diào)；但是ALA-PDT作用后6h與8h上述剪切體下調(diào)；而且，ALA-PDT作用后，A375細(xì)胞與A431細(xì)胞出現(xiàn)PARP前體的下調(diào)和剪切體的上調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　4.Cyt-c免疫組化結(jié)果顯示ALA-PDT作用前，陽性反應(yīng)在皮膚癌A375細(xì)胞與 A431細(xì)胞胞質(zhì)核周出現(xiàn)棕黑色沉淀；ALA-