苯并[α]芘對櫛孔扇貝分子毒理學機制的研究.pdf

1、本文根據(jù)目前我國近海多環(huán)芳烴污染現(xiàn)狀，選擇近海養(yǎng)殖的經(jīng)濟貝類櫛孔扇貝(Chlamys farreri)為研究對象，克隆了櫛孔扇貝的幾種解毒代謝相關(guān)基因，包括芳烴受體蛋白(AhR)、混合功能氧化酶中的CYP4、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶中的GSTpi和外源物質(zhì)抗性蛋白Pgp。研究了苯并[α]芘(BαP)作用下櫛孔扇貝組織內(nèi)BαP累積規(guī)律、解毒代謝酶的表達調(diào)控規(guī)律以及DNA損傷效應，并結(jié)合細胞毒性實驗研究解毒代謝酶在DNA損傷形成中的作用，探討B(tài)αP

2、對櫛孔扇貝的致毒的分子機制。本研究可為近海多環(huán)芳烴生物標志物檢測技術(shù)的建立提供理論依據(jù)，為解析多環(huán)芳烴對貝類的毒理學機制提供研究基礎(chǔ)。
　　 櫛孔扇貝芳烴受體蛋白ChfAhR的cDNA全長為2891bp，開放閱讀框為2466bp，編碼821個氨基酸殘基，無信號肽，為胞內(nèi)蛋白，含有三個核定位序列。BLAST分析表明ChfAhR與其它物種AhR基因具有較高的同源性，預測的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfAhR含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)

3、(DNA結(jié)合區(qū))和PAS結(jié)構(gòu)域(配體結(jié)合區(qū))，屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族。序列分析表明，ChfAhR的bHLH-PAS功能區(qū)與無脊椎動物相似性較高，與脊椎動物相似性較低。半定量RT-PCR分析表明ChfAhR在消化盲囊中有較高的表達，其次在成熟♀性腺中，鰓、外套膜和閉殼肌中表達量較少。
　　 櫛孔扇貝CYP450基因ChfCYP4的cDNA全長為1927bp，開放閱讀框為1317bp，編碼438個氨基酸殘基，為胞內(nèi)蛋白，含

4、有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號位點。BLAST分析表明ChfCYP4與其它物種ChfCYP4基因具有較高的同源性，預測的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfCYP4推導的氨基酸序列中存在細胞色素P450家族半胱氨酸血紅素鐵簽名序列(F461SAGPRNCIG470)，簽名序列中血紅素鐵結(jié)合位點Cys386高度保守。半定量RT-PCR分析表明ChfCYP4在成熟♀性腺和外套膜中有較高的表達，其次在鰓、消化盲囊和閉殼肌中也有一定的表達量。
　　

5、櫛孔扇貝GSTpi基因ChfGSTpi的cDNA全長為692bp，開放閱讀框為618bp，編碼205個氨基酸殘基，為胞內(nèi)蛋白。BLAST分析表明ChfGSTpi與其它物種GSTpi基因具有較高的同源性，預測的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfGSTpi氨基酸序列包括位于氮端的谷胱甘肽結(jié)合區(qū)(GSH binding site，G-site)和碳端的外源物質(zhì)非特異性結(jié)合位點(H-site)，配體結(jié)合活性位點Tyr109高度保守。半定量RT-

6、PCR分析表明ChfGSTpi在外套膜中表達量最高，在其它組織中也有較高的表達。
　　 櫛孔扇貝ChfPgp部分片段cDNA為1345bp，開放閱讀框為630bp，編碼210個氨基酸殘基。BLAST分析表明ChfPgp與其它物種Pgp基因的相應片段同源性較高，預測的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已知物種相似。ChfPgp氨基酸序列包括位于氮端的ATP結(jié)合區(qū)和ABC轉(zhuǎn)運位點L107SGGQKQRVA116等保守區(qū)域。半定量RT-PCR分析表明Ch

7、tPgp在外套膜中表達量最低，在其它各組織中均有較高的表達。
　　 BαP(0.05、0.2、0.8pg/L)染毒10d清除5d測得的櫛孔扇貝消化盲囊中的BαP累積量顯著高于軟體部中的累積量，濕重表示時，消化盲囊中BαP累積量約為軟體部中BαP累積量11.8倍減5.9，干重表示時，消化盲囊中BαP累積量約為軟體部中BαP累積量5.7倍加0.2。BαP脅迫對BαP累積量、GSTpi表達水平和DNA加合物含量的影響具有時間劑量效應，

8、GSTpi表達水平、DNA加合物含量和8-OHdG含量與組織中BaP累積呈顯著正相關(guān)，DNA加合物/8OHdG-BaP累積量回歸曲線為指數(shù)方程，BaP累積量-GSTpi表達量回歸曲線為雙曲線單矩三因子方程。ChfAhR和ChfCYP4表達變化未見明顯的時間-劑量效應，與組織累積量的相關(guān)性亦不顯著，但顯示了BaP對ChfAhR表達具有一定的誘導作用而對ChfCYP4具有一定的抑制作用，由結(jié)果可見GSTpi、DNA加合物和8-OFtdG與B