血紅素氧合酶-1在AMPK抑制心肌肥大中的作用.pdf

1、目的和意義:心肌肥大是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素,是高血壓、瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心臟病等臨床常見(jiàn)疾病的一種并發(fā)癥。近年來(lái)已有大量研究表明單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)對(duì)心肌肥大具有抑制作用,血紅素氧合酶-1(HO-1)即熱休克蛋白32(HSP32),是血紅素氧合酶(HO)的同工酶之一,HO-1在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均被證實(shí)能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌肥厚的進(jìn)展,能調(diào)節(jié)AngⅡ所致的心血管重

2、構(gòu)過(guò)程,為研究HO-1在AMPK抑制心肌肥大中的作用,AMPK激活對(duì)心肌肥大的影響及機(jī)制,我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究,觀察AMPK激活對(duì)心肌肥大的影響,及其對(duì)eNOS、p38MAPK的作用以及NOS/NO、p38MAPK在HO-1激活中的作用,探討AMPK對(duì)激活HO—1的作用及機(jī)制。從而闡明HO—1在AMPK抑制心肌肥大中的作用。
　　 方法與結(jié)果:本研究在AngⅡ誘導(dǎo)的新生乳鼠心肌細(xì)胞肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏^察了AMPK的激活劑5-氨基-4-甲

3、酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside,AICAR)對(duì)心肌細(xì)胞HO-1的激活效果,并進(jìn)一步探討了p38、NO和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在AMPK激活HO—1中的作用。并通過(guò)測(cè)定細(xì)胞面積及亮氨酸攝入率評(píng)價(jià)心肌肥大的影響。具體方法及結(jié)果如下:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):新生大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)
　　 2.確定AMPK對(duì)HO—1激活
　　 首先確定AICAR對(duì)

4、AMPK的激活,以10.7 mM AngⅡ[1]刺激心肌細(xì)胞肥大,建立AngⅡ誘導(dǎo)的新牛乳鼠心肌細(xì)胞肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在此模型上以Western Blot觀察AngⅡ、AICAR、Compound C對(duì)心肌細(xì)胞中AMPK蛋白表達(dá)的影響,證實(shí)AICAR對(duì)AMPK的激活作用及Compound C對(duì)AICAR激活作用的阻斷。繼而觀察AMPK對(duì)HO-1激活的濃度梯度,從而確定AMPK激活HO-1的最佳濃度:10-7 mM AngⅡ刺激心肌細(xì)胞肥大,

5、建立AngⅡ誘導(dǎo)的新牛乳鼠心肌細(xì)胞肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在此模型上以不同濃度(0.5,1.0,3.0mM)AICAR誘導(dǎo)AMPK的激活,24小時(shí)后以RT-PCR、Western Blot分別測(cè)定HO-1 mRNA及蛋白水平變化,確定對(duì)HO-1激活最明顯的AICAR濃度作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)所用,然后觀察AMPK對(duì)HO-1激活的時(shí)間曲線,用上述確定的AICAR濃度分時(shí)間點(diǎn)干預(yù)心肌細(xì)胞,干預(yù)細(xì)胞后4,6,8,12,24小時(shí)后以RT-PCR及Westem B

6、lot觀察HO—1的表達(dá),確定HO-1表達(dá)最明顯的時(shí)間點(diǎn)為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)所用。用上述實(shí)驗(yàn)所得的AICAR的濃度及時(shí)間點(diǎn)干預(yù)心肌細(xì)胞,Western Blot測(cè)定HO-1的蛋白水平表達(dá),分組:正常對(duì)照組(Control)、AngⅡ組、AngⅡ+AICAR組、AngⅡ+AICAR+Compound C組。
　　 結(jié)果:AngⅡ與AICAR能激活HO-1,AICAR對(duì)HO-1的激活呈劑量和時(shí)間上的相關(guān)性:1.0mM濃度AICAR激活HO-

7、1最明顯；而AICAR激活HO-1的最明顯的時(shí)間點(diǎn)為8小時(shí)。用1.0mM AICAR干預(yù)肥大的心肌細(xì)胞8小時(shí)后,觀察HO-1的表達(dá),結(jié)果顯示與Control相比,AngⅡ組、AICAR組HO-1表達(dá)均增加,AICAR組表達(dá)最高,而AngⅡ+AICAR+Compound C組HO—1表達(dá)無(wú)增高,與正常對(duì)照組接近,表明AMPK對(duì)HO-1起激活作用,阻斷AMPK的激活則能阻斷AICAR對(duì)HO-1的激活。
　　 3.探討AMPK激活HO

8、-1的機(jī)制.
　　 1)eNOS及p38在AMPK激活HO-1中的作用。首先觀察AMPK對(duì)p38磷酸化激活的時(shí)間梯度,在AngⅡ誘導(dǎo)的新生乳鼠心肌細(xì)胞肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1.0mM AICAR干預(yù)心肌細(xì)胞不同時(shí)間后(30,60min,2,4,8,16,24h)以Western Blot測(cè)定p38磷酸化形式的表達(dá),確定其激活最明顯的時(shí)間。然后在此時(shí)間點(diǎn)上觀察eNOS及p38在AMPK激活HO-1中的作用,即通過(guò)阻斷eNOS和p38觀察e

9、NOS及p38對(duì)HO—1的影響。分組Control,AngⅡ,AngⅡ+AICAR,AngⅡ+L-NAME(eNOS阻斷劑),AngⅡ+SB203580(p38阻斷劑),AngⅡ+AICAR+L-NAME,(根據(jù)文獻(xiàn)選擇SB203580、L-NAME濃度),以Westernblot測(cè)定HO-1的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:AngⅡ及AICAR均能引起p38 MAPK磷酸化形式的表達(dá)增高,AICAR對(duì)磷酸化p38的激活呈時(shí)間上的相關(guān)性

10、,表達(dá)高峰出現(xiàn)在4小時(shí),激活持續(xù)至24小時(shí)。在AICAR處理后4小時(shí)觀察阻斷eNOS、p38對(duì)HO-1的影響,結(jié)果提示:阻斷p38能明顯減弱HO-1的表達(dá),而阻斷eNOS對(duì)HO-1的激活有減弱作用,但不明顯。
　　 2)Nrf2在AMPK激活HO—1中的作用在AngⅡ誘導(dǎo)的新牛乳鼠心肌細(xì)胞肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?于AICAR處理后8小時(shí)通過(guò)免疫熒光觀察激活及阻斷eNOS、p38對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響,分組:AngⅡ,AngⅡ+AICAR

11、,AngⅡ+AICAR+SB203580,AngⅡ+AICAR+L-NAME。
　　 結(jié)果:AngⅡ、AngⅡ+AICAR組Nrf2在核內(nèi)表達(dá)增多,而正常對(duì)照組及AngⅡ+AICAR+SB203580,在核內(nèi)表達(dá)較少。AngⅡ+AICAR+L—NAME組Nrf2核內(nèi)表達(dá)與AngⅡ、AngⅡ+AICAR組相近。
　　 4.評(píng)價(jià)AMPK激活對(duì)心肌肥大的影響
　　 通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài),并用計(jì)算機(jī)輔助軟件

12、對(duì)細(xì)胞表面積進(jìn)行測(cè)量；以及采用[3H]亮氨酸摻入法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成以評(píng)價(jià)心肌肥大。檢測(cè)AngⅡ,AICAR,L-AME,ZnPPIX(HO—1阻斷劑)和SB203580對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響。分組:Control,AngⅡ,AngⅡ+AICAR,AngⅡ+AICAR+L—NAME,AngⅡ+AICAR+ZnPPIX,AngⅡ+AICAR+SB203580。
　　 結(jié)果:AngⅡ能引起心肌細(xì)胞面積增大,蛋白質(zhì)合成增加,而AIC

13、AR能阻斷AngⅡ引起的心肌肥大效應(yīng)；阻斷p38和HO-1的激活則能減弱AICAR的抑制心肌肥大作用,表現(xiàn)為加入阻斷劑后心肌細(xì)胞表面積增大,蛋白合成率增加。而阻斷eNOS則對(duì)心肌面積,蛋白質(zhì)合成率無(wú)影響。
　　 結(jié)論:1、AMPK具有抑制心肌肥大的作用,AMPK在HO-1的激活中起重要作用,HO-1作為AMPK的下游因子在AMPK抗心肌肥大的機(jī)制中起重要作用。2、AMPK對(duì)HO-1的激活主要通過(guò)磷酸化P38 MAPK,引起轉(zhuǎn)錄因