HIV-1 RNA雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測定方法及其質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的系列研究.pdf

1、目的：建立新型的采用病毒樣顆粒作為內(nèi)質(zhì)控的HIV-RNA雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測定方法。制備無生物傳染危險(xiǎn)性且耐RNase的HIV-1RNA檢測血清質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于臨床實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價(jià)工作。 方法： 一、HIV-RNA雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測定方法。 1. 從美國Los Alamos國家實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站下載所有已知HIV-1序列，采用DNAMAN和BioEdit軟件進(jìn)行比對，獲

2、取HIV-1序列的保守區(qū)域序列。再利用軟件Primer Express(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針設(shè)計(jì)，并初步建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系。 2. 在上述的HIV-1 RNA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系中，加入上面設(shè)計(jì)的不同的探針和引物，檢測本室構(gòu)建表達(dá)的內(nèi)含HIV-1 RNA的病毒樣顆粒和HIV-1感染患者樣本，篩選合適的引物和探針。初步確定了雙引物雙探針的檢測體系。根據(jù)雙引物雙探針體系構(gòu)建重組質(zhì)粒表達(dá)內(nèi)含HI

3、V-1 RNA內(nèi)標(biāo)的病毒樣顆粒，確定內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒在反應(yīng)體系中的最適濃度。通過不同添加劑的加入和不同酶混合物的調(diào)整優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)體系。 3.采用兩條不同的熒光探針和兩組引物進(jìn)行國際標(biāo)準(zhǔn)血清盤和HIV-1感染者血清標(biāo)本的HIV-1RNA檢測，并利用上述構(gòu)建表達(dá)的病毒樣顆粒作為內(nèi)標(biāo)以進(jìn)行假陰性質(zhì)控，考察了所建立方法的檢測靈敏度和特異性。比較了單探針和雙探針檢測方法在亞型檢測能力、檢測靈敏度和臨床樣本的檢測適用性。 二、

4、MS2包膜蛋白的原核表達(dá)、純化以及抗MS2蛋白多克隆抗體的制備及其與RNA的體外相互作用。 1.構(gòu)建表達(dá)包膜蛋白的pET<,42>-COAT、pGEX-4t-1-COAT原核表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1-COAT真核表達(dá)質(zhì)粒。原核表達(dá)重組MS2包膜蛋白。將重組蛋白利用親和柱進(jìn)行純化，純化后的包膜蛋白進(jìn)行尿素梯度透析。 2.分別采用原核表達(dá)重組蛋白免疫1號(hào)和3號(hào)兩只家兔、采用真核質(zhì)粒DNA疫2號(hào)和4號(hào)兩只家兔，制備抗MS2蛋

5、白的多克隆抗體。 3.配制體外包裝緩沖液，加入包膜蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子，加入適量RNA酶抑制劑。4℃過夜，電泳觀察遷移率變動(dòng)情況。 三、無生物傳染危險(xiǎn)性HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和室間質(zhì)量評價(jià)應(yīng)用的研究。 1.無生物傳染性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大量原核表達(dá)，采用兩次超速離心進(jìn)行純化，獲得大量HIV-1病毒樣顆粒。 2.研究HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在3

6、7℃、室溫、4℃、-20℃以及-70℃至室溫反復(fù)凍融5次的樣本穩(wěn)定性。同時(shí)研究質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性，并采用匹基公司HIV-1核酸檢測試劑盒和COBAS Ampicor HIV-1 1.5 Motlitor試劑與HIV-1 RNA國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比對定值。 3.調(diào)查開展HIV-1 RNA檢測的實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放20份樣本同時(shí)附帶相同的操作說明及結(jié)果報(bào)表，開展臨床實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評價(jià)。 結(jié)果： 一、HIV-1

7、RNA雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測定方法通過比對設(shè)計(jì)了10對引物探針，經(jīng)過篩選建立了雙引物雙探針體系。采用1000拷貝/ml的病毒樣顆粒作為內(nèi)部假陰性質(zhì)控，建立的雙特異探針檢測HIV-1實(shí)時(shí)熒光RT—PCR方法的靈敏度為125IU/ml，和單探針方法比較不存在大的差別；在檢測HTV-1陰性樣本時(shí)具有100％的特異性。和單探針方法比較，雙特異探針檢測HIV一1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法在HIV-1亞型檢測中能檢測到M族的所有亞型以及O族；雙特

8、異探針檢測HIV-1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測體系檢測中國藥品生物制品檢定所提供的9株國內(nèi)流行株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC的分型血清時(shí)均能檢出；在對60份臨床樣本的檢測中，單探針方法只能檢出39份，而雙探針方法能檢出50份(10份檢測陰性的樣本用COBAS檢測證明為陰性)。 二、MS2包膜蛋白的基因工程表達(dá)純化、抗MS2蛋白多克隆抗體的制備及其與RNA的體外相互作用完成了MS2包膜蛋白的原核表達(dá)和

9、純化。通過質(zhì)粒免疫和重組蛋白免疫的方法獲得了抗MS2包膜蛋白的多克隆抗體，1和3兩只家兔血清在稀釋1280000倍后仍然可以與重組MS2包膜蛋白反應(yīng)，而2和4兩只家兔血清只能在8000倍左右稀釋后呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。從RNA遷移率改變實(shí)驗(yàn)證明了包膜蛋白可以和包裝位點(diǎn)具有特異性相互作用，但經(jīng)過RNaseA的消化后RNA條帶消失，說明了RNA和包膜蛋白的在體外發(fā)生了作用但未能形成完整的病毒樣顆粒。 三、無生物傳染危險(xiǎn)性HIV-1 RNA測

10、定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和室間質(zhì)量評價(jià)應(yīng)用的研究無生物傳染危險(xiǎn)性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在37℃、室溫、-200℃以及2-8℃保存情況下其性能并無明顯改變。在室溫條件下能穩(wěn)定3周：在37℃條件下能穩(wěn)定10天；-20℃以及2-8℃保存情況下能穩(wěn)定4周以上；反復(fù)凍融5次對無生物傳染危險(xiǎn)性的HIV-1核酸檢測參考品沒有明顯影響：無生物傳染危險(xiǎn)性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，適合臨床使用和開展臨床實(shí)驗(yàn)室室間

11、質(zhì)量評價(jià)，從而保證臨床檢測質(zhì)量。病原體核酸檢測的主要問題在于低濃度樣本的檢測。病原體核酸檢測質(zhì)量保證還需要進(jìn)一步做好室內(nèi)質(zhì)控和參加室問質(zhì)量評價(jià)來進(jìn)行保證。 結(jié)論： 建立的雙引物雙特異探針檢測HIV-1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法具有很高的檢測靈敏度以及HIV-1亞型的檢測能力。在對臨床樣本的檢測中證明具有很好的臨床適用性。因此，該方法具有良好的應(yīng)用前景。 無生物傳染危險(xiǎn)性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性