實時rt-pcr1

1、1實時逆轉(zhuǎn)錄實時逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系（重慶400016）舒朝忠羅進勇綜述尹一兵康格非審校[摘要]：實時RTPCR是一種新技術(shù)，它利用熒光實時檢測PCR反應(yīng)，靈敏度高、特異性好、節(jié)約時間。本文對分子燈塔、DNA結(jié)合染色、雜交探針和水解探針四種方法的原理、特點作了簡要的介紹。并比較了三種可供選擇的儀器，即ABIPrism7700、Lightcycler和BiadiCycler各自的特點。使用特定的儀器、選擇不同的實時RT

2、PCR策略，可以將實時RTPCR應(yīng)用于絕對定量、檢測點突變和等位基因和mRNA結(jié)合變量，并可通過優(yōu)化設(shè)計，實現(xiàn)多重RTPCR。關(guān)鍵詞：逆轉(zhuǎn)錄PCR定量探針對于檢測來自有限組織標本中低含量mRNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranionpolymerasechainreaction，RTPCR)是一種敏感的方法。但是，RTPCR在重復(fù)性和特異性方面還存在一些問題。最近發(fā)展起來的以熒光定量為基礎(chǔ)的實時逆轉(zhuǎn)錄PCR(realtimerev

3、ersetranionpolymerasechainreaction)，是對RTPCR的極大改進和優(yōu)化，它不僅最大限度地克服了RTPCR的一些缺點，還具有自身突出的優(yōu)點和特點。因此，其應(yīng)用前景十分廣闊。本綜述討論實時RTPCR的所涉及的幾個重要方面，對比常規(guī)RTPCR和實時RTPCR，介紹實時PCR策略，推薦幾種可進行實時RTPCR的儀器，并簡介實時RTPCR的應(yīng)用。一、實時RTPCR的特點：實時RTPCR是將熒光技術(shù)應(yīng)用于RTPCR，

4、即使用熒光染料或熒光標記的探針，與PCR過程中的擴增產(chǎn)物結(jié)合，在PCR的每一次循環(huán)中，都可觀察到熒光強度的變化，這種變化對應(yīng)于擴增產(chǎn)物量的增加，通過繪制標準曲線，最終可得到反應(yīng)初期的靶基因數(shù)量。實時RTPCR用特定的儀器將RTPCR的擴增、檢測和結(jié)果分析結(jié)合在一起，實現(xiàn)了真正意義上的實時絕對定量，相比于常規(guī)RTPCR，實時RTPCR具有以下特點：1.實時測定、節(jié)約時間常規(guī)RTPCR在PCR反應(yīng)后，常需要使用凝膠電泳、DNA測序、Sout

5、herblot等方法對結(jié)果進行人工或自動化定量，這些后續(xù)步驟不僅使測定時間變長，而且在樣品的傳遞過程中還增加了污染的機會，而實時RTPCR不需要擴增后的這些處理就可直接對待測樣本實時定量，同時，從逆轉(zhuǎn)錄開始到完整定量結(jié)束整個過程，都可實現(xiàn)自動化，這極大地節(jié)約了時間和勞動力。2.重復(fù)性好、測定偏差小RTPCR的重復(fù)性可用循環(huán)閾值來衡量，循環(huán)閾值的定義是：在實時RTPCR過程中，連續(xù)不斷地監(jiān)測反映體系中熒光信號的變化，當信號增強到某一閾值（

6、根據(jù)熒光信號基線的平均值和平均標準差，計算出以99.7%的置信度大于平均值的熒光值，即為閾值）時，此時的循環(huán)次數(shù)即為循環(huán)閾值。實時逆轉(zhuǎn)錄PCR循環(huán)閾值的變異系數(shù)在2%以下，而常規(guī)RTPCR變異系數(shù)多在14%左右。毫無疑問實時逆轉(zhuǎn)錄PCR比常規(guī)RTPCR的測定偏差明顯減小。3.靈敏度高、特異性好3計增添了靈活性。4.水解探針水解探針方法利用DNA多聚酶的5’核酸外切酶活性來水解與目的序列雜交的探針，通常使用的是Taq或Tth聚合酶，但實際

7、上任何具有5’核酸外切酶活性的酶均可使用[4]。先設(shè)計一個可與目的序列特異性雜交的單鏈探針，長度為20～30bp此探針的的5’端含有一個熒光報告基團，其發(fā)射的熒光可被探針3’端的熒光抑制基團吸收或抑制，探針的3端已被封閉，不具有延伸能力。在沒有與探針互補的目的序列存在時，探針保持游離，由于Taq或Tth聚合酶的5’核酸外切酶活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針仍保持完整熒光信號不改變。當有相應(yīng)的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)時，探針在PCR的變性階段可與其

8、雜交，雜交位點一般在擴增序列的中部，聚合酶引導(dǎo)引物延伸，當?shù)竭_探針雜交位點時，將探針從序列上替換下來，同時聚合酶發(fā)揮5’核酸外切酶活性水解探針，把探針5’端的熒光染料切割下來（切口平移效應(yīng)），使熒光報告基團與熒光抑制基團分離，從而產(chǎn)生熒光，熒光信號對應(yīng)于上次循環(huán)末期或本次循環(huán)初期所存在的擴增產(chǎn)物的數(shù)量。有三個參數(shù)可影響水解探針法，即完整探針的淬滅、探針的雜交效率和聚合酶的切割效率。三、儀器目前市面上有三種儀器可實現(xiàn)對RTPCR的實時監(jiān)測

9、，所有儀器都使用封閉的試管系統(tǒng)進行操作，不需擴增后的處理即可定量，這避免了污染問題，并節(jié)約了時間。所有儀器從逆轉(zhuǎn)錄到完整定量，都實現(xiàn)了自動化，使得它們很適合于大量樣本的篩選。ABIPrism7700有一個固定的熱循環(huán)儀（96孔），它能檢測500～600nm的熒光。通過光纖的多元排列，將激發(fā)光分配到微孔反應(yīng)管中，激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光再通過光纖傳遞回去，直接進入帶有電荷偶聯(lián)裝置（gecoupleddeviceCCD）照相機的色譜儀，進行光譜結(jié)

10、果分析。Lightcycler在小體積的玻璃毛細管中進行RTPCR，這種毛細管位于一個類似轉(zhuǎn)子的傳送帶上，傳送帶運送毛細管到一個發(fā)射藍光的二極管（激發(fā)波長為470nm），激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光可被三個光電探測二極管讀取，每個光電探測二極管具有不同的濾波長度，分別為530、640和710nm，使得可以使用不同光譜特性的熒光探針。Lightcycler可監(jiān)測PCR反應(yīng)的每一次循環(huán)，是真正的實時測定。BiadiCycler是最近才投放市場的，它的

11、特點是：有一個可改變波長的激發(fā)光源，具有比ABIPrism7700和Lightcycler更寬的熒光檢測范圍，可達到400～700nm；不像ABIPrism7700對樣本順序掃描，BiadiCycler可同時掃描96個樣本，掃描頻率可自行設(shè)定；可同時檢測四種不同顏色的熒光，更加適合于多元分析；可用于各種實時RTPCR定量策略，在反應(yīng)進程中隨時可分析樣本數(shù)據(jù)。因此，BiadiCycler比ABIPrism7700和Lightcycler在

12、反應(yīng)設(shè)計上更具靈活性。四、實時RTPCR的應(yīng)用1.直接定量使用實時RTPCR可對待測樣本中的RNA進行絕對定量，其定量原理是實時RTPCR的門檻循環(huán)與反應(yīng)體系中的初始模板數(shù)量（即樣本中的待測基因數(shù)量）的對數(shù)值之間有嚴格的線性關(guān)系，利用陽性梯度標準品的Ct值制成標準曲線，在的到樣本的Ct值后，可在標準曲線上根據(jù)直線回歸計算出待測樣本的初始拷貝數(shù)。直接定量通過分子燈塔、DNA結(jié)合染色、雜交探針和水解探針均可實現(xiàn)。這幾種方法已被應(yīng)用在許多定量