轉(zhuǎn)ipt基因及細(xì)胞工程草地早熟禾的抗逆性分析.pdf

1、草地早熟禾(Poa pratensis L.)屬冷季型草坪草，是溫帶地區(qū)重要的草坪草種之一。它具有色美、耐蔭、耐修剪、耐踐踏等優(yōu)點(diǎn)，能形成稠密的草皮，常用于草坪和綠地的建植中，但它也具有不耐炎熱、抗旱力不強(qiáng)等缺點(diǎn)。由于草地早熟禾多采用兼性無融合方式繁殖，采用常規(guī)的育種方法培育新品種受到很大的限制。植物細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)的發(fā)展為提高草地早熟禾品種的抗逆性提供了一條新途徑。 轉(zhuǎn)ipt基因草地早熟禾的獲得及耐冷性分析異戊烯基轉(zhuǎn)移酶

2、(isopentenyl transferase，IPT)是細(xì)胞分裂素合成途徑的限速酶，過量表達(dá)ipt基因的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為細(xì)胞分裂素(CTK)含量增加，葉片衰老延遲。本工作以草地早熟禾無菌種子苗莖尖為材料，在附加適宜濃度6-BA和2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生并繼代培養(yǎng)，建立起了高效的叢生芽離體培養(yǎng)體系。然后以叢生芽芽尖為受體，利用根瘤農(nóng)桿菌(菌株LBA4404，攜帶mini-Ti質(zhì)粒pCAMBIAl300-ipt-bar)介導(dǎo)法

3、將來源于根瘤農(nóng)桿菌的ipt基因轉(zhuǎn)入3個(gè)草地早熟禾優(yōu)良品種中，經(jīng)增殖后，移栽至花盆。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR和Southern blotting檢測(cè)證實(shí)，ipt基因已轉(zhuǎn)入草地早熟禾中。 對(duì)轉(zhuǎn)ipt基因的草地早熟禾和對(duì)照株系進(jìn)行分蘗數(shù)比較，得出轉(zhuǎn)正義ipt基因株系的分蘗數(shù)明顯高于非轉(zhuǎn)基因株系的，轉(zhuǎn)反義株系的與對(duì)照植株差異不大。對(duì)離體葉片在不同條件下進(jìn)行褪綠實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)正義基因株系的持綠性優(yōu)于對(duì)照株系。 將離體葉片在4℃下進(jìn)行褪

4、綠試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義ipt基因植株葉片的持綠時(shí)間明顯長于非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)反義的植株的，而非轉(zhuǎn)基因植株與轉(zhuǎn)反義基因植株之間顯差不明顯。在濟(jì)南自然過冬條件下，對(duì)轉(zhuǎn)正義ipt基因株系和各自的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N進(jìn)行耐冷性比較分析。植株形態(tài)觀察表明，轉(zhuǎn)正義基因植株具有明顯提高的耐冷性，持綠期較長。生理指標(biāo)測(cè)定表明，在10℃/1℃(晝/夜)溫度下，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的差異不顯著；隨著氣溫的降低，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)凍害表型的時(shí)間晚，細(xì)胞膜受

5、損傷程度低，葉綠素含量較高，即轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照有更好的持綠性；在-8℃處理5天后，轉(zhuǎn)基因植株也受害較輕，丙二醛含量和離子滲漏率較低。并且不同轉(zhuǎn)基因株系的耐冷性存在明顯差異，其中部分株系表現(xiàn)出比對(duì)照品種顯著提高的耐冷性，具有很好的應(yīng)用前景。草地早熟禾細(xì)胞工程植株的耐熱性分析本實(shí)驗(yàn)室以繼代培養(yǎng)的草地早熟禾叢生芽芽塊為材料，經(jīng)過49℃熱脅迫處理和對(duì)存活株的選育，獲得了一批耐熱株系。本工作對(duì)這些通過細(xì)胞工程途徑獲得的耐熱株系進(jìn)行了耐熱性分析。

6、 細(xì)胞工程植株和對(duì)照植株移栽到紙杯中，放于23℃下生長，選取生長狀態(tài)一致的植株分別進(jìn)行46℃ 5小時(shí)和40℃ 3天的熱脅迫處理，并進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。 經(jīng)46℃ 5小時(shí)的熱脅迫處理后，各株系葉片的丙二醛含量和離子滲漏率都升高，但經(jīng)過耐熱篩選株系的升高幅度低于對(duì)照株；葉綠素?zé)晒夂腿~綠素含量的測(cè)定結(jié)果也說明對(duì)照株光合系統(tǒng)受損較嚴(yán)重。即經(jīng)過耐熱篩選的株系具有提高的耐熱性。對(duì)各項(xiàng)生理參數(shù)的測(cè)定還發(fā)現(xiàn)，各生理指標(biāo)對(duì)熱脅迫應(yīng)答的速