棉花雄性不育及黃萎病菌誘導(dǎo)相關(guān)microRNA的表達(dá)分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類在真核生物體內(nèi)普遍存在的、長(zhǎng)度約為19～25nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為基因表達(dá)中的一類負(fù)調(diào)控子，不僅能夠調(diào)控植物花器官的發(fā)育，而且在植物感受逆境脅迫而做出適應(yīng)性調(diào)整的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。因此探討miRNAs在雄性不育和抗黃萎病中的調(diào)控機(jī)制，可以為雄性不育在棉花雜種優(yōu)勢(shì)上的利用和棉花抗病育種提供新的途徑。
　　本研究利用miRNA芯片、高通量測(cè)序和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2、相結(jié)合的方法，鑒定棉花中的miRNAs及其靶基因，探討這些miRNAs在雄性不育和抗黃萎病中的調(diào)控機(jī)制。分析雄性不育相關(guān)以及脅迫誘導(dǎo)條件下棉花miRNA的差異表達(dá)情況，探討差異表達(dá)miRNA在花粉發(fā)育過(guò)程和抗逆反應(yīng)中所起的作用，為闡明棉花雄性不育的分子機(jī)理和抗黃萎病的調(diào)控途徑提供參考。主要結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)比較不育株和可育株花器官形態(tài)發(fā)現(xiàn)，不育株花較小，雄蕊花絲極短、花藥不開(kāi)裂，花粉完全敗育。在普通生物顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不育株

3、花粉在花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂時(shí)期出現(xiàn)異常，單核期開(kāi)始出現(xiàn)大量小孢子裂解，花藥發(fā)育的全過(guò)程中均出現(xiàn)了小孢子裂解現(xiàn)象。
　　2.分別提取不育株和可育株花粉造孢細(xì)胞時(shí)期、花粉母細(xì)胞時(shí)期和花粉粒時(shí)期花蕾RNA進(jìn)行microRNA芯片雜交試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在不育株花粉發(fā)育的三個(gè)時(shí)期，分別檢測(cè)到407、369、401條miRNAs，在可育株花粉發(fā)育的三個(gè)時(shí)期，分別檢測(cè)到146、286、343條miRNAs。其中，有54條miRNAs在不育株和可育

4、株花粉中達(dá)到了顯著差異表達(dá)水平。另外，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到35個(gè)miRNA的靶基因，其中大多數(shù)靶基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子，它們可能在花粉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　3.為了檢測(cè)miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)狀況，利用Solexa測(cè)序?qū)γ藁ā?1A”不育株和可育株花粉母細(xì)胞時(shí)期花蕾進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，我們共得到1，742條顯著差異表達(dá)的基因，其中有12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與到花粉發(fā)育。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的途徑顯著性富集分析，鑒

5、定了差異表達(dá)基因參與花粉發(fā)育過(guò)程中的主要代謝途徑，例如，戊糖和葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)換途徑、類單萜類生物合成途徑、、倍半萜類生物合成途徑、淀粉蔗糖代謝途徑、半乳糖苷酶代謝途徑、亞麻酸代謝途徑、過(guò)氧物酶體代謝途徑等。miR159、miR319、miR172等家族miRNAs的靶基因（MYB、AP2等）在轉(zhuǎn)錄水平上出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，它們可能參與了基因轉(zhuǎn)錄、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝調(diào)控途徑。
　　4.為了研究雄性不育相關(guān)miRNA在抗病反應(yīng)中的作用，

6、以高抗黃萎病品種海島棉7124和易感品種冀棉11為材料，對(duì)棉花進(jìn)行黃萎病菌脅迫處理，利用高通量Solexa測(cè)序和生物信息學(xué)分析，鑒定得到140個(gè)已知miRNA和58個(gè)novel miRNA;篩選出了兩種棉花材料之間以及在不同處理?xiàng)l件下中差異表達(dá)的miRNA。共有26和19個(gè)miRNA在海島棉7124和冀棉11中受黃萎病菌侵染后誘導(dǎo)表達(dá)差異顯著，在正常生長(zhǎng)和黃萎病菌浸染條件下，分別有35個(gè)和38個(gè)miRNA在兩種棉花栽培種之間表達(dá)量有顯著

7、差異。其中，在花粉發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用的miR156、miR172、miR399、miR414等家族的miRNAs參與了棉花抗黃萎病反應(yīng)過(guò)程。
　　5.以高抗黃萎病品種海島棉7124和易感品種冀棉11為材料，對(duì)棉花進(jìn)行黃萎病菌脅迫處理，利用降解組測(cè)序測(cè)序方法，鑒定得到棉花中107個(gè)miRNAs的靶基因，其中，SBP and SPL transcription factor、NAC domain-containing prote

8、in、ClassⅢ HD-Zipprotein、AP2-1ike factor、F-box/RNI-like superfamily protein和growth-regulating factor(GRF)、MYB轉(zhuǎn)錄因子、leucine-rich repeat(LRR)-containing protein和LRR and NB-ARCdomain-containing disease resistance-like protein