脅迫誘導(dǎo)棉花microRNA的差異表達(dá)分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的、非編碼單鏈小RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 作為基因表達(dá)中的一類負(fù)調(diào)控子，不僅在植物新陳代謝、器官發(fā)育及組織分化中起重要的作用，而且可以響應(yīng)植物的生物和非生物逆境脅迫，在植物感受逆境脅迫而做出適應(yīng)性調(diào)整的過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，對脅迫誘導(dǎo)miRNA進(jìn)行研究，有助于探明植物逆境適應(yīng)反應(yīng)的“成因機理”以及miRNA所介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為提高轉(zhuǎn)基因植物抵抗脅迫的能力提供新的途徑。<

2、br>　　 本研究選用高鹽和黃萎病兩種代表性的環(huán)境脅迫（前者是非生物脅迫，后者是生物脅迫）對棉花進(jìn)行脅迫處理，利用生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證相結(jié)合的方法，鑒定了棉花中的miRNA，分析了脅迫誘導(dǎo)條件下棉花miRNA的差異表達(dá)情況，初步探討了差異表達(dá)miRNA 在抗逆反應(yīng)中所起的作用，為闡明棉花耐鹽和抗黃萎病的調(diào)控途徑提供參考。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.在miRBase數(shù)據(jù)庫(Release 10.1)中篩選出保守的植

3、物miRNA家族，并以它們的序列作為“種子序列”應(yīng)用于同源搜索miRNA方法當(dāng)中，在EST、GSS和Core-Nucleotide數(shù)據(jù)庫中搜索預(yù)測miRNA，從而改進(jìn)miRNA 計算機預(yù)測方法。
　　 2.利用改進(jìn)的miRNA 計算機預(yù)測方法預(yù)測了棉花等作物中的miRNA。在預(yù)測的得到的棉花miRNA中，有2個來自于GSS序列,3個來自于Core-Nucleotide序列，其余的16個來自于EST序列。
　　 3.利用m

4、iRNA 芯片驗證以上預(yù)測得到的棉花miRNA，芯片雜交結(jié)果顯示其中10個屬于可檢測miRNA。利用熒光定量PCR 檢測了miRNA 在高鹽脅迫條件下，兩種棉花品系（耐鹽品系山農(nóng)91-11和鹽敏感品系魯棉6號）中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：高鹽脅迫條件下，miR156a、miR156d、miR156e和miR169在耐鹽品系山農(nóng)91-11中表達(dá)量下調(diào)，miR167a和miR399a表達(dá)量上調(diào)，而miR159在鹽敏感品系魯棉6號中表達(dá)量下調(diào)。<

5、br>　　 4.利用生物信息學(xué)預(yù)測得到棉花miRNA的靶基因共23個，利用熒光定量PCR 檢測了5個靶基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：高鹽脅迫條件下，SPL3，RNA helicase和HAP2 在耐鹽品系山農(nóng)91-11中表達(dá)量上調(diào)，而ARF8和Ghi.6739表達(dá)量下調(diào)。
　　 5.以陸地棉-冀棉11（易感黃萎?。┖秃u棉-海7124（抗黃萎病）為研究材料，分別建立了正常生長和黃萎病菌侵染條件下的四個小RNA 庫，然后利用高通量S

6、olexa測序共獲得68 970 173條小RNA序列；結(jié)合生物信息學(xué)分析得到215個棉花miRNA；不同樣本間小RNA種類及數(shù)量差異顯著，平均約有40％的Unique sRNA 為樣本特有sRNA。
　　 6.將四個小RNA庫中miRNA數(shù)量歸一化，比較miRNA表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示：在冀棉11中,38個miRNA在黃萎病菌侵染條件下表達(dá)量下調(diào)，15個miRNA表達(dá)量上調(diào)；在海7124中,24個miRNA在黃萎病菌侵染條件下