骨碎補(bǔ)對骨生長因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1研究設(shè)計(jì)隨機(jī)、盲法、對照、細(xì)胞培養(yǎng) 2研究背景隨著社會的發(fā)展，交通運(yùn)輸業(yè)的繁榮，各種運(yùn)動的頻繁開展，各種創(chuàng)傷、骨折已經(jīng)成為臨床常見病及多發(fā)病，嚴(yán)重危脅人類的健康和影響人們的勞動能力。如何早日促進(jìn)骨折愈合，是骨傷科領(lǐng)域的重點(diǎn)課題。中藥治療骨折具有悠久的歷史，并取得了卓越的臨床療效。是目前治療骨折的主要手段之一。由于中醫(yī)學(xué)在認(rèn)識論、方法論上的特殊觀、導(dǎo)致了它在闡述藥物作用機(jī)制仍停留在宏觀的水平。如何保持和發(fā)揚(yáng)中醫(yī)骨傷科的骨折治療特

2、色與優(yōu)勢，使中醫(yī)藥現(xiàn)代化走向世界是不可回避的問題。 骨折愈合是極其復(fù)雜的生物學(xué)修復(fù)過程。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者借助組織學(xué)、組織化學(xué)組織形態(tài)計(jì)量學(xué)，超微結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)等手段對骨折進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)觀察，對骨折愈合機(jī)制也進(jìn)行了廣泛的探討。臨床上應(yīng)用了促進(jìn)骨折愈合的多種方法，但骨折延遲愈合，不愈合的問題仍未完全解決，近年來，由于基因技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，人們對骨折愈合的認(rèn)識已從細(xì)胞生物學(xué)向分子生物學(xué)水平深化，并隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，已經(jīng)認(rèn)識

3、到骨折愈合與多種生物因子有關(guān)，除內(nèi)分泌、代謝因子等全身因子外骨折局部尚有大量的生長因子，對骨折愈合起著重要的調(diào)節(jié)作用。 中藥對骨折愈合相關(guān)基因的作用的研究近年來也已經(jīng)有了初步的進(jìn)展，導(dǎo)師董?；劢淌陬I(lǐng)導(dǎo)的課題：“中藥對骨折愈合過程中相關(guān)細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控的研究”即是從分子生物學(xué)水平探討中藥促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理，并且利用動物模型已經(jīng)完成了中藥阿膠、骨碎補(bǔ)、海螵蛸、水蛭等對骨折愈合過程中相關(guān)基因表達(dá)的研究，揭示出了不同中藥在不同時(shí)相對

4、不同基因表達(dá)的影響，為中藥促進(jìn)骨折愈合提供了理論基礎(chǔ)。中藥與骨折愈合過程中相關(guān)基因表達(dá)的研究目前尚處于起步階段，目前的研究主要集中于中藥對動物模型的作用方面，中藥與體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)的研究主要集中在中藥促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖方面，而利用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究中藥骨碎補(bǔ)與骨折愈合過程中相關(guān)基因表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。 3研究目的觀察中藥骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖功能的影響，以及中藥骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞TGF-β1，TGF-

5、βRⅡ、VEGF、bFGF及基因表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)水平探討骨碎補(bǔ)對骨折愈合的作用機(jī)制，為中藥促進(jìn)骨折愈合提供理論基礎(chǔ)。從而指導(dǎo)臨床骨折的治療。 4材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：骨碎補(bǔ)制備原藥液和含藥學(xué)清，用Wistar乳大鼠顱蓋骨分離原代成骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用藥劑量：骨碎補(bǔ)原藥液根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分為5mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL三個劑量組；含藥學(xué)清制備按人鼠體表面積法換算，以成人臨床等效劑量的7倍為低劑量組，低劑量組的2倍為中劑量

6、組，低劑量組的4倍為高劑量組。每日給藥2次，連續(xù)給藥3d后處死取血清。實(shí)驗(yàn)分組：空白血清對照組，細(xì)胞模型對照組，骨碎補(bǔ)原藥液低劑量組(0.1mg/mL)，骨碎補(bǔ)原藥液中劑量組(1mg/mL)，骨碎補(bǔ)原藥液高劑量組(5mg/mL)，骨碎補(bǔ)含藥血清低劑量組，骨碎補(bǔ)含藥血清中劑量組，骨碎補(bǔ)含藥血清高劑量組。實(shí)驗(yàn)干預(yù)：用骨碎補(bǔ)原藥液和含藥學(xué)清作用于第二代、第三代成骨細(xì)胞。標(biāo)本處理：免疫組化，取24孔板，將1×1cm玻片進(jìn)行處理后放入，取大鼠成骨

7、細(xì)胞以4×103的密度種植于24孔板中，繼續(xù)用10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。吸棄上清液加入10﹪血清的各條件液進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后吸棄上清，并用PBS(0.1M，PH7.4)洗三次，用10﹪甲醛溶液固定30min后備用。RT-PCR，取大鼠成骨細(xì)胞以4×103的密度種植于12孔板中，繼續(xù)用10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，吸棄上清液，加入10﹪血清的各條件液進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，冷PBS(0.

8、01M，PH7.4)沖洗2次，加入TRIzol，每孔0.5ml，反復(fù)吹打3min，吸取TRIzol液放入1.5mlEppendorf管中，22℃靜止5min。然后放入-70℃冰箱中備用。檢測：MTT法檢測細(xì)胞增值率；RT-PCR法檢測TGF-β1mRNA、TGF-βRⅡmRNA、VEGFmRNA、bFGFmRNAmRNA；免疫組化檢測TGF-β1、TGF-βRⅡ、VEGF、bFGF表達(dá)，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，對骨生長因子表

9、達(dá)陽性細(xì)胞進(jìn)行平均灰度測定。 5結(jié)果5.1骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖功能的影響本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：與空白血清對照組比較，細(xì)胞模型對照組、骨碎補(bǔ)原藥液低劑量組、骨碎補(bǔ)原藥液中劑量組、骨碎補(bǔ)原藥液高劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清高劑量組的OD值明顯降低(P＜0.01)，骨碎補(bǔ)含藥血清低劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清中劑量組變化不明顯(P＞0.05)。與細(xì)胞模型對照組比較，骨碎補(bǔ)含藥血清低劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清中劑量組的OD值明顯升高(P＜0.01

10、)，骨碎補(bǔ)原藥液高劑量組明顯降低(P＜0.01)，骨碎補(bǔ)原藥液低劑量組、骨碎補(bǔ)原藥液中劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清高劑量組變化不明顯(P＞0.05)。從總體上看，骨碎補(bǔ)含藥血清組較骨碎補(bǔ)原藥液組OD值升高(P＜0.05)。 5.2骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-βRⅡ、VEGF、bFGF及基因表達(dá)的影響 5.2.1骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞TGF-β1及基因表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：與空白血清對照組比較，骨

11、碎補(bǔ)原藥液的三個劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清的低、中劑量組，TGF-β1mRNA的表達(dá)減少(P＜0.05)，骨碎補(bǔ)含藥血清的高劑量組沒有明顯差異(P＞0.05)。與細(xì)胞模型對照組比較，空白血清對照組表達(dá)增加(P＜0.05)。其余無差異(P＞0.05)。TGF-β1表達(dá)結(jié)果：與空白血清對照組比較，各組間無顯著差異(P＞0.05)。與細(xì)胞模型對照組比較，各組間無顯著差異(P＞0.05)。TGF-βRⅡmRNA表達(dá)結(jié)果：與空白血清對照組比較，骨碎補(bǔ)

12、原藥液的低、中劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清的中劑量組表達(dá)減少(P＜0.05)，與細(xì)胞模型對照組比較，骨碎補(bǔ)原藥液的低劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清的中劑量組表達(dá)減少，骨碎補(bǔ)含藥血清的高劑量組表達(dá)增加(P＜0.01)。 5.2.2骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞VEGF及基因表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：與空白血清對照組比較，細(xì)胞模型組無顯著差異(P＞0.05)，骨碎補(bǔ)原藥液的三個劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清的低劑量組VEGFmRNA表達(dá)減少(P＜0.01)

13、，骨碎補(bǔ)含藥血清的中、高劑量組VEGFmRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。與細(xì)胞模型對照組比較，空白血清組VEGFmRNA的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，骨碎補(bǔ)原藥液的三個劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清的低劑量組VEGFmRNA表達(dá)減少(P＜0.01)，骨碎補(bǔ)含藥血清的中劑量組VEGFmRNA表達(dá)略增加，但無顯著意義(P＞0.05)。骨碎補(bǔ)含藥血清的高劑量組VEGFmRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。VEGF表達(dá)結(jié)果：與空白血清對照組比較

14、，細(xì)胞模型對照組、骨碎補(bǔ)原藥液低、高劑量組表達(dá)無差異(P＞0.05)，骨碎補(bǔ)原藥液中劑量組表達(dá)明顯減少(P＜0.01)、骨碎補(bǔ)含藥血清低劑量組表達(dá)減少(P＜0.05)，骨碎補(bǔ)含藥血清中劑量組表達(dá)增加(P＜0.05)，骨碎補(bǔ)含藥血清高劑量組表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。與細(xì)胞模型對照組比較，空白血清對照組、骨碎補(bǔ)原藥液低、高劑量組表達(dá)無差異(P＞0.05)，骨碎補(bǔ)原藥液中劑量組明顯減少(P＜0.01)、骨碎補(bǔ)含藥血清低劑量組表達(dá)減少(P＜

15、0.05)，骨碎補(bǔ)含藥血清中劑量組表達(dá)增加(P＜0.05)，骨碎補(bǔ)含藥血清高劑量組表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。 5.2.3骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞bFGF及基因表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：與空白血清對照組比較，細(xì)胞模型對照組、骨碎補(bǔ)原藥液的低、中劑量組bFGFmRNA表達(dá)減少(P＜0.01)，骨碎補(bǔ)原藥液的高劑量組bFGFmRNA無差異(P＞0.05)，骨碎補(bǔ)含藥血清的三個劑量組bFGFmRNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)

16、。與細(xì)胞模型對照組比較，空白血清對照組、骨碎補(bǔ)原藥液高劑量組及骨碎補(bǔ)含藥血清的三個劑量組bFGFmRNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)。并且骨碎補(bǔ)含藥血清的三個劑量組bFGFmRNA表達(dá)均明顯高于骨碎補(bǔ)原藥液三個劑量組(P＜0.01)。與空白血清對照組比較，細(xì)胞模型對照組、骨碎補(bǔ)原藥液低、高劑量組和骨碎補(bǔ)含藥血清低劑量組bFGF表達(dá)無差異(P＞0.05)，骨碎補(bǔ)原藥液中劑量組bFGF表達(dá)減少(P＜0.05)，骨碎補(bǔ)原藥液高劑量組和骨碎補(bǔ)

17、含藥血清低、中、高劑量組bFGF表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。與細(xì)胞模型對照組比較，骨碎補(bǔ)原藥液高劑量組、骨碎補(bǔ)含藥血清三個劑量組表bFGF達(dá)明顯增加(P＜0.01)，其余無明顯差異(P＞0.05)。 6結(jié)論6.1骨碎補(bǔ)對成骨細(xì)胞的增殖沒有明顯的促進(jìn)作用，并且，當(dāng)骨碎補(bǔ)的濃度達(dá)到一定時(shí)，還對成骨細(xì)胞的增殖有抑制作用。 6.2骨碎補(bǔ)對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞TGF-β1及TGF-β1mRNA的表達(dá)沒有明顯促進(jìn)作用；而骨碎補(bǔ)對體