嵌合型豬圓環(huán)病毒1-2b轉(zhuǎn)染方法優(yōu)化及PCV1-2b 1B和1C疫苗免疫保護(hù)效力研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員，包括PCV1(Porcine circovirus type1，PCV1)和PCV2(Porcine circovirustype2，PCV2)兩種血清型。PCV1是豬腎細(xì)胞系的一種污染物，對(duì)豬無(wú)致病性;PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasti

2、ng syndrome，PMWS)及其他豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）的主要病原。PCV2主要分為PCV2a和PCV2b兩個(gè)基因型，PCV2a包括2A-2E五個(gè)亞型;PCV2b包括1A、1B和1C三個(gè)亞型，其中1A、1B亞型的ORF2基因序列基本一致，進(jìn)一步區(qū)分需比較ORF1序列。1C亞型的ORF2基因與1A、1B相比有較大差異，其Cap蛋白C末端出現(xiàn)一個(gè)賴氨酸(K)的延伸。
　　PCV2已在全世界豬群蔓延，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)

3、濟(jì)損失。疫苗接種是預(yù)防PCV2感染的有效手段。然而疫苗免疫不能完全阻斷PCV2的感染和傳播，而且商品化的疫苗價(jià)格普遍居高，制約著PCV2疫苗的廣泛使用。因此研發(fā)安全、高效、低價(jià)的疫苗產(chǎn)品是今后研究的主要方向。本研究使用電穿孔轉(zhuǎn)染法證實(shí)Dulac細(xì)胞能顯著提高嵌合型PCV1-2b拯救效率，突破病毒增殖的瓶頸;大量制備嵌合型PCV1-2b活病毒，動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗的斷奶仔豬主動(dòng)免疫及新生仔豬被動(dòng)免疫保護(hù)效果。<

4、br>　　1.Dulac細(xì)胞拯救嵌合型PCV1-2b的轉(zhuǎn)染方法優(yōu)化
　　本研究通過(guò)優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法，將本室保存的pSK-dPCV1-2b重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Dulac細(xì)胞和PK-15細(xì)胞，旨在提高嵌合型豬圓環(huán)病毒PCV1-2b的拯救效率，為疫苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)果顯示，Dulac細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的病毒滴度為PK-15細(xì)胞的100倍;Dulac細(xì)胞電轉(zhuǎn)染的優(yōu)化參數(shù)為250 V、400μs、6μg質(zhì)粒DNA、電擊3次，各

5、因素對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響依次為電場(chǎng)強(qiáng)度、電擊次數(shù)、脈沖時(shí)間及質(zhì)粒DNA含量。Dulac細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染優(yōu)化結(jié)果為:在質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例為1∶3時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Dulac細(xì)胞電轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的感染率，結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別占55.6％和44.2％，提示兩種方法轉(zhuǎn)染Dulac細(xì)胞的效率均較高。分別將拯救的病毒在Dulac細(xì)胞和PK-15細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代，結(jié)果病毒滴度隨著傳代數(shù)呈上升趨勢(shì)，但Dulac細(xì)胞病毒滴度(104.44

6、-105.32)顯著高于PK-15細(xì)胞(101.90-103.38)。因此，嵌合型PCV1-2b在Dulac細(xì)胞中增殖滴度更高，優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法均能有效提高Dulac細(xì)胞的病毒拯救效率。
　　2.嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗免疫保護(hù)效力比較
　　根據(jù)PCV2ORF1的保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和TaqMan探針，建立PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，并評(píng)價(jià)其敏感性、特異性和重復(fù)性。結(jié)果顯示

7、，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.55，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率為96.4％，具有良好的線性關(guān)系;該方法的敏感性為5.0 copies/μL;檢測(cè)的PCV1-2、PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV基因組DNA或cDNA均無(wú)擴(kuò)增曲線;8份陽(yáng)性樣品的變異系數(shù)在0.98％-1.03％之間。因此，本研究建立的PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性良好，為嵌合型PCV1-2b疫苗免疫保護(hù)效力評(píng)估提供了科

8、學(xué)有效方法。
　　用抗原含量為2×105.0 TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和2×104.0 TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b活疫苗分別免疫商品豬，并以商品化PCV2b全病毒滅活疫苗作對(duì)照，評(píng)估兩種疫苗的免疫保護(hù)效力。結(jié)果顯示，免疫組試驗(yàn)豬均能迅速產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，活疫苗免疫豬血清抗體和中和抗體產(chǎn)生更早，高水平抗體維持時(shí)間更長(zhǎng)。TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)攻毒后血清和腹股溝淋巴結(jié)PCV2 DNA拷貝數(shù)，

9、結(jié)果攻毒對(duì)照試驗(yàn)豬血清和腹股溝淋巴結(jié)檢測(cè)到大量的PCV2核酸載量，活疫苗組攻毒后21d能完全消除PCV2增殖，而滅活疫苗組有1頭豬血清樣品檢測(cè)到PCV2核酸(105.55 copies/mL);滅活疫苗和活疫苗組均有2頭試驗(yàn)豬腹股溝淋巴結(jié)檢測(cè)到PCV2 DNA載量（108.28、107.50 copies/g和105.93、105.57copies/g），嵌合型PCV1-2b活疫苗組低于滅活疫苗組，但差異不顯著(P＞0.05)。病理組織

10、學(xué)觀察結(jié)果顯示，攻毒對(duì)照豬可見(jiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)性支氣管肺炎病變，淋巴結(jié)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞缺失和組織細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，IHC檢測(cè)呈PCV2抗原陽(yáng)性，而免疫組病變比攻毒對(duì)照組輕微。PCV2可通過(guò)口、鼻、糞尿等排泄物進(jìn)行傳播，將病毒液接種試驗(yàn)豬后發(fā)現(xiàn)，攻毒對(duì)照豬鼻拭子和肛拭子樣品中PCV2核酸載量顯著高于免疫組試驗(yàn)豬(P＜0.05)。因此，嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，降低PCV2水平傳播的風(fēng)險(xiǎn)，可作為防控PCV2

11、感染的候選疫苗。
　　3.嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫母豬對(duì)所產(chǎn)仔豬免疫保護(hù)作用
　　嵌合型PCV1-2b滅活疫苗對(duì)斷奶仔豬的免疫保護(hù)效力已經(jīng)在第二章得到證實(shí)，本研究將制備的嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫妊娠母豬，對(duì)其所產(chǎn)14日齡，28日齡和42日齡仔豬進(jìn)行攻毒，評(píng)價(jià)新生仔豬的被動(dòng)免疫保護(hù)效力。
　　結(jié)果顯示14日齡仔豬攻毒前母源抗體滴度最高，平均值為1∶300，28日齡和42日齡仔豬血清抗體水平逐漸下降，平均值

12、分別為1∶133和1∶70，至49日齡時(shí)血清中幾乎無(wú)母源抗體。14日齡仔豬僅在攻毒后14 d有1頭豬血清中檢測(cè)到低拷貝數(shù)的病毒載量(104.90copies/mL)，淋巴結(jié)觀察到輕微的淋巴細(xì)胞缺失，IHC檢測(cè)為陰性;28日齡仔豬母源抗體較低，PCV2攻毒后14 d和21 d分別有2頭豬出現(xiàn)不同程度的病毒血癥（分別為105.36copies/mL、106.39 copies/mL和107.84 copies/mL、107.90 copie

13、s/mL）;42日齡仔豬攻毒后，PCV2在體內(nèi)的增殖得不到有效抑制，攻毒后7d血清中有1頭豬檢測(cè)到PCV2核酸拷貝數(shù)，21 d的血清和淋巴結(jié)病毒載量接近攻毒組水平，平均值分別達(dá)106.31 copies/mL和1010.77copies/g,組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞流失嚴(yán)重并伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，IHC檢測(cè)到棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞。因此，本研究證明了嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫妊娠母豬，14日齡仔豬獲得良好的保護(hù)效力，28和42日齡仔豬被動(dòng)免疫保

14、護(hù)降低;將仔豬的首免日期定在28日齡左右。
　　4.嵌合型PCV1-2b1B和1C亞型滅活疫苗免疫保護(hù)效力比較
　　本研究以本室保存的pSK-sPCV1-2b1C重組質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建pSK-dPCV1-2b1B感染性克隆，電穿孔轉(zhuǎn)染法拯救嵌合型PCV1-2b1B病毒，動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫保護(hù)效力的差異。
　　生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)顯示，兩株嵌合型PCV1-2b呈現(xiàn)相似的增殖特性。試驗(yàn)豬免疫后產(chǎn)生快速的體

15、液免疫應(yīng)答，能顯著降低機(jī)體PCV2病毒載量，但免疫組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。嵌合型PCV1-2b1B滅活疫苗誘導(dǎo)的熒光抗體和中和抗體略高，血清病毒含量較低，在攻毒后14d和21 d能完全抑制PCV2b增殖，腹股溝淋巴結(jié)不攜帶PCV2b核酸，IHC檢測(cè)呈陰性;嵌合型PCV1-2b1C滅活疫苗組攻毒后21 d不能完全抑制病毒增殖，1頭豬血清中檢測(cè)到病毒載量（105.75 copies/mL）;腹股溝淋巴結(jié)亦有1頭豬可檢測(cè)到PCV2b