豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的分離鑒定及滅活疫苗的研究與應用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）感染是近些年新發(fā)現(xiàn)的豬的傳染病，主要包括斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、懷孕母豬繁殖障礙（SAMS）、斷奶豬和育肥豬的呼吸道疾?。≒RDS）、豬皮炎和腎炎綜合征（PDNS）、幼齡仔豬A2型先天性震顫（CT）、間質性肺炎（IP）、增生性壞死性肺炎（PNP）等。PCV2感染能降低豬體免疫力，常引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染，加重病情。該病在世界許多國家和地區(qū)的廣泛流行，已經造成了巨大的經濟損失，嚴重影響著世

2、界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
　　 本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬2型圓環(huán)病毒（PCV）基因序列，設計一對PCV2特異性引物。利用PCR方法，對湖北省18個規(guī)?；i場的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS）的258頭病豬的淋巴結、脾臟組織進行PCR檢測。檢測到陽性病例170份，陽性檢出率為65.8％，說明該病在湖北省普遍存在。
　　 1．將PCR檢測陽性病料組織研磨、離心、過濾除菌，接種到無PCV1型污染的PK-15細胞進行

3、分離。病毒在PK-15細胞上盲傳6代后，提取病毒DNA，利用PCV2特異性引物對細胞培養(yǎng)物進行PCR檢測，獲得陽性結果，表明PCV2在無PCV1污染的PK-15細胞中增殖培養(yǎng)成功。用ORF2單抗間接免疫熒光試驗可觀察到PCV2特異性免疫熒光。由此說明，分離出的病毒為豬圓環(huán)病毒2型，分別命名為PCV2WH株、HT株和HB株。
　　 對分離的三株PCV2毒株進行序列分析。測序結果表明：分離到的3株PCV2的ORF2基因大小相同，都為

4、702 bp；其核苷酸與參考毒株的同源性為98.2％～99.7％，氨基酸同源性為81.2％'97.4％；本研究分離的3株同源性為99.5％～99.7％；3株湖北分離毒株與國內其他省份的分離株的親緣關系較近，同源性為98.2％～99.1％，處在同一條大的分支上。
　　 2．本研究針對分離鑒定的PCV2-WH株通過四種不同的方法進行病毒增殖優(yōu)化培養(yǎng)：（1）細胞與病毒同步接種并用300 mm的D-氨基葡萄糖處理；（2）同步接種不用D-

5、氨基葡萄糖處理；（3）不同步接種并用D-氨基葡萄糖處理；（4）不同步接種不用D-氨基葡萄糖處理。通過傳統(tǒng)PCR和熒光定量PCR檢測病毒增殖結果表明：同步接種并用D-氨基葡萄糖處理的病毒含量比其他三種培養(yǎng)工藝所獲病毒量分別提高了12.8％，14.7％，56.7％。第二代中，同步接種并用D-氨基葡萄糖處理的病毒含量比其他三種培養(yǎng)工藝所獲病毒量分別提高了55.8％，85.3％，73.3％。因此，在體外培養(yǎng)條件下，獲得最大PCV2滴度的方法就是

6、采取同步接種并用D-氨基葡萄糖處理的工藝。
　　 3．疫苗的制備與應用。針對目前豬2型圓環(huán)病毒疫苗已在預防PCV2上發(fā)揮了顯著的效果。部分進口商品化PCV2疫苗逐漸走進我國市場，我國各科研單位也正在自主研發(fā)國產化的PCV2疫苗。本研究將分離鑒定的PCV2-WH毒株在PK-15細胞上增殖，通過優(yōu)化培養(yǎng)獲得較高滴度病毒作為抗原，制備了全病毒油乳劑滅活疫苗，對國家生豬產業(yè)體系對口試驗站的一些規(guī)?；i場進行了田間試驗，對4-5周齡的仔豬