碘對(duì)體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響.pdf

1、[目的] 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞免疫組化技術(shù)、流氏細(xì)胞儀技術(shù)及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)等多種方法初次研究碘濃度高低對(duì)體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)與功能的影響；觀察不同碘濃度在相同時(shí)間段對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，為探討微量元素碘對(duì)人體的影響與作用提供有效的實(shí)驗(yàn)支持，豐富對(duì)碘的實(shí)驗(yàn)研究。 [材料與方法] 1、細(xì)胞培養(yǎng)：以含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)ECV304內(nèi)皮細(xì)胞株，傳代待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行

2、各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 2、制備單細(xì)胞懸液密度為0.8～1.0×105/ml，種24孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的碘化鉀，每板均設(shè)對(duì)照組，于4、8、12、24、48小時(shí)時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。 3、MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在碘處理后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔添加MTT試劑20μl(5mg/m1)，37℃孵育4h、8h、12h、24h及48h后終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，振

3、蕩10min。用酶標(biāo)分析儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)其光吸收值(OD)，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。 4、細(xì)胞免疫組化：將消毒好的蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板，種細(xì)胞，貼壁后加入實(shí)驗(yàn)因素，培養(yǎng)12h及24h后終止。除去培養(yǎng)基，PBS沖洗，滴加一抗二抗，顯色前用鑷子小心將蓋片取出進(jìn)行DAB顯色，觀察PCNA的表達(dá)。 5、流式細(xì)胞儀技術(shù)：待測(cè)細(xì)胞經(jīng)離心-PBS沖洗-吹勻-固定-再離心-沖洗-吹打-染色(4℃，20-30分鐘)后，400目尼龍網(wǎng)過(guò)

4、濾后上機(jī)檢測(cè)。Cell quest分析軟件分析，用細(xì)胞分裂增殖指數(shù)(PI)表示相對(duì)增殖力。PI=(S+G<,2>/M)/(Go/Gl+S+G<,2>/M)。 6、細(xì)胞代謝功能檢測(cè)：利用試劑盒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)和超氧化物岐化酶(SOD)活性進(jìn)行檢測(cè)。 [結(jié)果] 1、加碘培養(yǎng)4h-12h時(shí)，60-300μgI<'->/L劑量組對(duì)ECV-304細(xì)胞增殖活力有明顯刺激作用，隨著碘作用時(shí)間的延長(zhǎng)

5、及碘劑量的增加細(xì)胞的增殖活力明顯減弱。 2、投碘后12小時(shí)細(xì)胞免疫組化顯示60-400μgI<'->/L劑量組的細(xì)胞PCNA表達(dá)顯著增多，而對(duì)照及其它劑量組表達(dá)弱甚至無(wú)表達(dá)。 3、投碘后的內(nèi)皮細(xì)胞功能受到了一定影響，LPQ與SOD產(chǎn)量發(fā)生了波動(dòng)，第一階段(碘濃度在300μg/L以?xún)?nèi)，培養(yǎng)在12小時(shí)內(nèi))LPO含量增加，SOD含量相應(yīng)增加；第二階段(碘濃度高于300μg/L)LPO含量增加，SOD含量逐漸迅速減少。