茶多酚對(duì)大鼠及體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是絕大多數(shù)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，纖維蛋白溶解系統(tǒng)在防止血栓形成，保證血流通暢方面有重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的組織型纖溶酶原激活物（tissue—type plasminogen activator，t—PA）和纖溶酶原激活物抑制劑—1（type—1 plasminogen activator inhibitor，PAI—1）是纖溶系統(tǒng)外源性激活途徑中最重要的兩種活性物質(zhì)，二者

2、之間的平衡是體內(nèi)纖溶功能的決定因素。蛋氨酸的代謝產(chǎn)物同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作為AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已經(jīng)得到證實(shí)，Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能是引起AS的主要機(jī)制之一。茶多酚（tea polyphenols，TP）是從茶葉中提取的一類多羥基酚類化合物的總稱，TP對(duì)AS的防護(hù)作用已受到廣泛關(guān)注，但其機(jī)制尚未完全明了，尤其是關(guān)于TP能否通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能來(lái)防治AS的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)高蛋氨酸飲食和Hcy分別誘導(dǎo)

3、大鼠和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）纖溶功能損傷，觀察給予TP后t—PA和PAI—1蛋白水平和mRNA水平的變化，旨在從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)綜合探討TP對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用和對(duì)纖溶功能的影響，通過(guò)翔實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為TP抗AS提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。 方法： 1．TP對(duì)體外培養(yǎng)的HUVEC纖溶功能的保護(hù)作用 1．1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HUVE

4、C復(fù)蘇后，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。 1．2 四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法篩選TP和Hcy濃度 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC分為TP組和Hcy組，各組分別加入不同濃度的TP和Hcy，使TP終濃度分別為12．5、25、50、100、200μg/ml，Hcy終濃度分別為0．5、1、2、4mmol/L，同時(shí)各組分別設(shè)溶劑對(duì)照組和不接種細(xì)胞的空白對(duì)照，培養(yǎng)24

5、h后采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率。 1．3 10μg/ml TP對(duì)t—PA、PAI—1含量及mRNA水平的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC分為4組：Hcy組：加入終濃度為0．5 mmol/L的Hcy； TP組：加入終濃度為10μg/ml的TP； Hcy+TP組：加入終濃度為0．5mmol/L的Hcy與10μg/ml的TP；對(duì)照組：加入等體積溶劑。各組培養(yǎng)24 h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中的t—

6、PA和PAI—1含量，RT—PCR法檢測(cè)細(xì)胞t—PA和PAI—1 mRNA水平。 1．4 不同給予方式，不同濃度TP對(duì)t—PA、PAI—1含量的影響 1．4．1 同時(shí)給予TP和Hcy組：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按下列分組同時(shí)給予不同處理因素：Hcy組、2μg/ml TP+Hcy組、4μg/ml TP+Hcy組、8μg/ml TP+Hcy組、16μg/ml TP+Hcy組、對(duì)照組。各組Hcy終濃度均為0．5 mmol/L，對(duì)

7、照組加入等體積溶劑，ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中的t—PA和PAI—1含量。 1．4．2 先給予Hcy組：按上述方法接種細(xì)胞并分組后，各組先給予終濃度為0．5mmol/L的Hcy作用12 h，換液，Hcy組與正常對(duì)照組加入等體積溶劑，其余四組分別給予2、4、8、16μg/ml TP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中的t—PA和PAI—1含量。 2．TP對(duì)大鼠纖溶功能的保護(hù)作用研究 2．1 動(dòng)物分組

8、 健康Wistar雄性大鼠（200±20g）50只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、TP低、中、高劑量組共5組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組及TP組均喂飼含3%蛋氨酸的飼料，同時(shí)各TP組每天經(jīng)灌胃分別給予50 mg/kg·bw TP、100mg/kg·bw TP和200 mg/kg·bw TP，灌胃量為0．5 ml/100g·bw；對(duì)照組喂飼正?；A(chǔ)飼料，對(duì)照組和模型組同時(shí)經(jīng)灌胃給予等容量的蒸餾水。大鼠喂養(yǎng)8周后禁食12 h斷頭處死

9、。 2．2 指標(biāo)測(cè)定 ELISA法測(cè)定大鼠血漿t—PA和PAI—1含量；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT—PCR）檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈t—PA和PAI—1mRNA水平的變化；蘇木素—伊紅（HE）染色觀察主動(dòng)脈弓病理變化；SABC免疫組織化學(xué)法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈弓t—PA和PAI—1蛋白表達(dá)；試劑盒測(cè)定大鼠血清丙二醛（malondialdehyd

10、e，MDA）含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH—Px）活性、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量以及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性；全自動(dòng)生化儀測(cè)定大鼠血清甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（totalcholesterol，TC）含量。 結(jié)論： 1．Hcy和TP濃度分別達(dá)到1 mmol/L、200μg/ml即

11、對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。 2．Hcy能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變和纖溶功能紊亂，TP通過(guò)調(diào)節(jié)PAI—1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，維持PAI—1和t—PA的平衡狀態(tài)，預(yù)防并修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶功能。 3．高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞移行增生和內(nèi)皮纖溶功能紊亂，TP能夠抑制平滑肌增生，并通過(guò)調(diào)節(jié)t—PA和PAI—1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平維持PAI—1和t—PA的平衡狀態(tài)，從而修復(fù)纖溶功能，防止AS的發(fā)生發(fā)展。 4．TP可降