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文檔簡介
1、目的:周圍神經(jīng)損傷后,缺損的替代修復(fù)是一直臨床關(guān)注的熱點(diǎn),尚未得到完全解決。長期以來,自體神經(jīng)移植被公認(rèn)為修復(fù)缺損周圍神經(jīng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但由于可供移植的自體神經(jīng)有限,同時(shí)供區(qū)常常伴有不同程度的副損傷,而且容易造成供區(qū)感覺或運(yùn)動功能障礙、創(chuàng)傷性神經(jīng)瘤形成、手術(shù)難度大以及軸突生長錯(cuò)位等問題,因此,尋找一種理想的自體神經(jīng)的替代材料修復(fù)缺損的周圍神經(jīng)成為近年來周圍神經(jīng)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。然而,到目前為止,組織工程神經(jīng)移植的效果還不是很理想,與自體神
2、經(jīng)移植的效果相比還有差距,如缺損的神經(jīng)過長或較粗大,或?yàn)榧‰?、骨外露等血供不良的?chuàng)面時(shí),修復(fù)效果不好。是因?yàn)榻M織工程神經(jīng)移植區(qū)的再血管化延遲,在早期不能及時(shí)建立內(nèi)在有效的血液循環(huán),導(dǎo)致缺血缺氧,部分種子細(xì)胞死亡,神經(jīng)再生的質(zhì)量降低。因此,找到解決人工神經(jīng)移植區(qū)血管化的有效方法是決定人工神經(jīng)移植成功的關(guān)鍵因素之一。
雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞,具
3、有支持、保護(hù)、分隔、營養(yǎng)、趨化和促進(jìn)再生的神經(jīng)纖維成熟等主要功能,同時(shí)能夠產(chǎn)生一些神經(jīng)營養(yǎng)因子,通過多種途徑作用于受損的周圍神經(jīng),進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)功能的恢復(fù),在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)性再生過程中起著非常關(guān)鍵的作用。因而提高損傷局部雪旺細(xì)胞的增殖能力及數(shù)量能夠更好地促進(jìn)受損周圍神經(jīng)的功能恢復(fù)。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelia cells,VECs)為覆蓋在血管內(nèi)表面的單層扁平細(xì)胞,不僅是位于血液和血管壁之間的一個(gè)選擇性通
4、透屏障,而且是毛細(xì)血管重要組成部分。正常神經(jīng)組織內(nèi)血管較豐富,神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)分布有毛細(xì)血管網(wǎng),是神經(jīng)組織與營養(yǎng)物質(zhì)的橋梁,并保證神經(jīng)纖維的生成和正常功能的發(fā)揮。
本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖且匝┩?xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)為組織工程人工神經(jīng)血管的形成提供接近天然的條件,并進(jìn)一步證明兩種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)能夠在血管形成的基礎(chǔ)上為雪旺細(xì)胞提供營養(yǎng)并促進(jìn)其生長,同時(shí)找到兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的最適比例,進(jìn)而嘗試找到一種理想的促進(jìn)組織工程人工神經(jīng)血管化的方法,為最
5、終實(shí)現(xiàn)組織工程人工神經(jīng)移植的臨床應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1、胎兔雪旺細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)取懷孕28天的新西蘭白兔,耳緣靜脈注入空氣處死,常規(guī)消毒、鋪無菌巾,迅速剖腹取胎兔,在無菌條件下取其坐骨神經(jīng),并去除神經(jīng)外膜及束膜,Hank's液沖洗5遍,剪碎,使用雙酶消化法獲取SCs,以雙30min差速貼壁法及培養(yǎng)過程中先加入Arab-C(終末濃度為10-5mmol/l)去除和抑制纖維母細(xì)胞,后換成含
6、NGF(40ng/ml)培養(yǎng)液促進(jìn)SCs生長,每日在倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)后的第2代SCs用S-100抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定并計(jì)算其濃度,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后可移除培養(yǎng)液,用胰酶消化后用細(xì)胞刮匙收集細(xì)胞于培養(yǎng)液中待用。
2、胎兔血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)以相同方法取出胎兔,在無菌條件下,取出胎兔胸主動脈,PBS反復(fù)沖洗管腔內(nèi)外,以傳統(tǒng)的酶消化法獲得VECs,在培養(yǎng)液中加入血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothe
7、liagrowth factor,VEGF)促進(jìn)VECs增殖,每日在倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)后的第2代VECs用FⅧRA抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定并計(jì)算其濃度,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后可移除培養(yǎng)液,用胰酶消化后用細(xì)胞刮匙收集細(xì)胞于培養(yǎng)液中待用。
3、雪旺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)取傳至第3代的胎兔SCs和VECs,將SCs與VECs以1:1、2:1、4:1的比例聯(lián)合直接共培養(yǎng)于加入20%胎牛血清的DMEM及M199的混合培養(yǎng)基中,
8、設(shè)為實(shí)驗(yàn)組A、B、C三組,同時(shí)將SCs單獨(dú)培養(yǎng)設(shè)為對照組D。在兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的第1、3、5、7天時(shí),進(jìn)行SCs細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制其生長曲線,檢測VECs對SCs的影響。
結(jié)果:
1、雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果觀察體外培養(yǎng)的SCs約第7天爬滿6cm培養(yǎng)皿。在倒置顯微鏡下觀察:SCs形態(tài)多為梭形,有突起,雙極,偶見三個(gè)細(xì)胞突起:細(xì)胞核明顯,呈卵圓形;細(xì)胞呈端對端、肩并肩、旋渦狀或柵欄狀排列生長,并用S-100抗體免疫細(xì)胞化學(xué)
9、染色證實(shí)為SCs;少量纖維母細(xì)胞呈“煎雞蛋”樣,胞體較雪旺細(xì)胞大,扁平狀,外形不規(guī)則,突起短而多,核仁明顯,約2到3個(gè),顏色較雪旺細(xì)胞淺。
2、血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果觀察每天在倒置顯微鏡下觀察VECs生長情況:VECs初為圓形或橢圓形,立體感和折光性較強(qiáng),數(shù)目不等成堆聚集,多呈小團(tuán)集落,6~8天完全匯合形成連續(xù)的單層細(xì)胞,融合成片后外觀呈特征性的“鵝卵石”樣形態(tài),排列致密,細(xì)胞質(zhì)豐富;傳代VECs個(gè)體較小,為短梭形、方形或
10、多角形細(xì)胞,折光性小,細(xì)胞立體形態(tài)加強(qiáng),鏡下形成“鋪路石”樣改變,并用FⅧRA免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)為VECs。
3、雪旺細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)的結(jié)果觀察各組SCs數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加,其中在共培養(yǎng)第1天,各實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞數(shù)量無差異(P>0.05),從共培養(yǎng)第3天起至第7天,實(shí)驗(yàn)組A(SCs與VECs比例為1:1)、C(SCs與VECs比例為4:1)細(xì)胞計(jì)數(shù)與對照組D有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組B(S
11、Cs與VECs比例為2:1)與對照組D無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而與其他兩實(shí)驗(yàn)A、C組有顯著差異(P<0.05)。
結(jié)論:
1、在體外培養(yǎng)SCs過程中,使用雙差速貼壁法可以去除大部分纖維母細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)初期使用Arab-C能抑制纖維母細(xì)胞生長,后期培養(yǎng)液中加入NGF可促進(jìn)SCs生長,從而獲得大量的純度達(dá)90%以上的SCs。
2、在體外培養(yǎng)VECs過程中,采用傳統(tǒng)的酶消化法獲取VECs,
12、在培養(yǎng)液中加入VEGF可以促進(jìn)VECs增殖,不僅抑制VECs在缺氧狀態(tài)下的凋亡,還可有效抑制平滑肌細(xì)胞的生長,同時(shí)控制恰當(dāng)?shù)哪z原酶消化的時(shí)間,從而獲得大量的純度達(dá)90%以上的VECs。
3、胎兔胸主動脈來源的VECs能在體外促進(jìn)胎兔SCs分化增殖;SCs與VECs的比例為2:1時(shí),VECs促進(jìn)SCs分化增殖的能力最強(qiáng)。
4、SCs與VECs共培養(yǎng)可以作為促進(jìn)組織工程人工神經(jīng)血管化的方法之一,為最終實(shí)現(xiàn)組織工程
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