趨化因子CXCL16-CXCR6在人早孕期母—胎界面的表達(dá)及調(diào)控作用.pdf

1、趨化因子是一組通常由70-90個氨基酸組成的小分子量(8．14KD)蛋白質(zhì)，通過與細(xì)胞膜相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮多種生物學(xué)作用。趨化因子家族目前包含50種趨化因子及18種趨化因子受體。其中CXCLl6是最新被鑒定的趨化因子，在體內(nèi)以細(xì)胞結(jié)合型和分泌型兩種方式存在，發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，CXCR6被確認(rèn)為它的唯一受體。既往我們研究發(fā)現(xiàn)，人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞高度轉(zhuǎn)錄CXCR6，因此推測其上游信號CXCLl6可能參與滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控。因此

2、我們圍繞母胎界面局部表達(dá)的CXCR6和CXCLl6進(jìn)行了本課題的研究設(shè)計，以探討這一獨(dú)特的趨化因子對在母胎界面的表達(dá)特征及其生物學(xué)意義。 1．人早孕母胎界面主要功能細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 母胎界面的胎兒面主要由滋養(yǎng)細(xì)胞組成，我們按照本實驗室建立的方法，進(jìn)行了絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定，收獲的細(xì)胞純度達(dá)90-95％。 母胎界面母體面的蛻膜主要由蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜免疫細(xì)胞構(gòu)成。以往國內(nèi)外關(guān)于蛻膜免

3、疫細(xì)胞的研究多限于單色熒光標(biāo)記白細(xì)胞抗原，難以真實反映各亞群細(xì)胞的實際數(shù)量。我們在研究中，設(shè)計了酶消化、Percoll密度梯度離心、短期培養(yǎng)結(jié)合的方法同時分離純化蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜免疫細(xì)胞，應(yīng)用多色熒光抗體同時標(biāo)記免疫細(xì)胞表面抗原，以鑒定蛻膜免疫細(xì)胞亞群。該方法分離得到的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞純度可達(dá)99％；我們采用三色、雙色、單色熒光直接標(biāo)記法，分別分析早孕婦女蛻膜、外周血NK細(xì)胞(CD3'CD56+CDl6‘和CD3-C

4、D56+CDl6+)、NKT細(xì)胞(CD3+CD56+)、γδT細(xì)胞(CD3+γδTCR+)、T細(xì)胞(cD3+和單核細(xì)胞(cDl4+)的陽性率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD56+CDl6-NK細(xì)胞約占蛻膜免疫細(xì)胞總數(shù)的(67．02±18．33)％，T細(xì)胞占(11．05±7．22)％，單核細(xì)胞占(5．28±0．29)％，NKT細(xì)胞占(235±1．62)％。早孕婦女外周血T淋巴細(xì)胞較正常生育期婦女明顯下降(p<0．05)；而早孕婦女外周血NK細(xì)胞、NKT細(xì)

5、胞、單核細(xì)胞數(shù)量與對照組相比無顯著差異。 2．趨化因子CXCLl6及其受體CXCR6在人早孕母胎界面的表達(dá) 本研究首先采用Real-timeRT-PCR和免疫化學(xué)的方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分析滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CXCLl6／CXCR6的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞均高表達(dá)CXCLl6／CXCR6。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞雖高水平轉(zhuǎn)錄CXCR6，低水平轉(zhuǎn)錄其配體CXCLl6；但CXCLl6和CXCR6在蛋白水平

6、的表達(dá)均很低。我們隨后采用多色熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)分析了蛻膜免疫細(xì)胞CXCR6的表達(dá)水平。結(jié)果顯示TbT細(xì)胞CXCR6的平均表達(dá)率最高，達(dá)(87．29±6．95)％；單核細(xì)胞和NKT細(xì)胞CXCR6呈中度表達(dá)，其陽性率分別為(47．71±6．04)％、(44．14±4．4)％；T細(xì)胞CXCR6的平均表達(dá)率為(30．39±5．23)％；而蛻膜CD56+CDl6'NK細(xì)胞和CD56+CDl6+NK細(xì)胞幾乎不表達(dá)CXCR6，其陽性率分別為(4．

7、79±1．3)％和(4．84±0．77)％，且兩者之間無顯著性差異(P>0．05)。 3．CXCLl6對人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞的自分泌調(diào)控作用 原代培養(yǎng)人滋養(yǎng)細(xì)胞100小時，收集培養(yǎng)上清檢測CXCLl6的分泌水平。ELISA分析發(fā)現(xiàn)：滋養(yǎng)細(xì)胞能夠持續(xù)分泌趨化因子CXCLl6，當(dāng)種植密度為1×10~cells／mi時，48h累積分泌濃度為1．65ng／ml，100h累積分泌濃度為2．69ng／ml。應(yīng)用IFN-?處理后，可啟動滋養(yǎng)

8、細(xì)胞內(nèi)CXCLl6的合成，上調(diào)CXCLl6的表達(dá)和分泌水平。而經(jīng)ADAMl0處理后，只能加速滋養(yǎng)細(xì)胞表面CXCLl6的釋放，不能促進(jìn)CXCLl6的合成。 外源性CXCLl6處理滋養(yǎng)細(xì)胞，3H-TdR摻入法和MTT比色法分析其對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCLl6能夠有效誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，而且呈明顯的量效依賴關(guān)系，其促增殖效應(yīng)可被相應(yīng)中和性抗體阻斷。在CXCLl6誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖后，我們采用Westemblot方法分析了

9、P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Akt的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)CXCLl6能夠迅速磷酸化滋養(yǎng)細(xì)胞中的Akt，在10-30min達(dá)最高峰，效應(yīng)持續(xù)時間不少于2小時。外源性CXCLl6處理滋養(yǎng)細(xì)胞，Matrigel侵襲試驗分析其對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)rhCXCLl6濃度低達(dá)10ng／ml時，即可明顯促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲：當(dāng)rhCXCLl6濃度為200ng／ml時，侵襲指數(shù)最高，這種侵襲效應(yīng)可被CXCLl6的中和性抗體阻斷。因此，CXCLl6不

10、僅促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，而且促進(jìn)其侵襲，在誘導(dǎo)增殖中可能啟動了細(xì)胞內(nèi)的P13K途徑。由于滋養(yǎng)細(xì)胞在各個分化階段均表達(dá)CXCLl6和CXCR6，據(jù)此可推測趨化因子CXCLl6可能參與滋養(yǎng)細(xì)胞的分化和胎盤形成。 4．人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌CXCLl6參與蛻膜免疫細(xì)胞的募集和粘附我們首先分離了人外周血單個核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析各群細(xì)胞CXCR6的表達(dá)水平。隨后采用Transwell法分析CXCLl6和滋養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)液(TCM)對PBMC

11、趨化能力的影響。結(jié)果顯示，CXCLl6可選擇性地趨化外周T細(xì)胞、76T細(xì)胞和單核細(xì)胞，對CD56+CDl6+NK細(xì)胞也具微弱的趨化效應(yīng)；來源于滋養(yǎng)細(xì)胞的TCM對于NK細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞均顯示很強(qiáng)的趨化活性；而抗CXCLl6抗體可以完全或部分抑制CXCLl6或TCM的趨化效應(yīng)。有趣的是，被TCM或CXCLl6趨化后的PBMC的構(gòu)成比例與蛻膜免疫細(xì)胞比例非常相似。 之后，我們分離了蛻膜免疫細(xì)胞重復(fù)了上述實驗，得到了類似的結(jié)果。即

12、CXCLl6選擇性地趨化蛻膜T細(xì)胞、75T細(xì)胞和單核細(xì)胞，TCM對于蛻膜的三種主要免疫細(xì)胞即NK細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞均表現(xiàn)很強(qiáng)的趨化能力，經(jīng)CXCLl6和TCM趨化后的蛻膜免疫細(xì)胞構(gòu)成比與趨化前相似。因此早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞合成和分泌的趨化因子CXCLl6不僅引導(dǎo)外周T細(xì)胞、75T細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入蛻膜，還使它們停留在滋養(yǎng)細(xì)胞附近的蛻膜組織中。 綜上所述，本研究首先建立了母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜免疫細(xì)胞的分離方法；系統(tǒng)研