nm23-H1在人早孕期母-胎界面的生物學(xué)調(diào)控作用.pdf

1、滋養(yǎng)細(xì)胞具有高增殖和侵襲潛能；但在正常妊娠，滋養(yǎng)細(xì)胞不發(fā)生過(guò)度增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提示可能受到細(xì)胞直接或間接作用的分子調(diào)控，使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力維持在生理性動(dòng)態(tài)平衡。母—胎界面微環(huán)境細(xì)胞與分子間的相互作用可以調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜及蛻膜。因此，母一胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控分子可以影響胚泡的正常植入和生長(zhǎng)。 23號(hào)非轉(zhuǎn)移性基因H1型（nm23—H1）是經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞侵襲抑制基因。在滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病中，nm23—H1的表達(dá)與預(yù)后密切

2、相關(guān)，可以作為評(píng)價(jià)滋養(yǎng)細(xì)胞疾病進(jìn)展的參考指標(biāo)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)nm23—H1可能對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的生理性侵襲發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，因此探尋nm23—H1表達(dá)調(diào)控將有助于闡明生理狀態(tài)下胚泡植入和病理性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的分子機(jī)制。 本研究在前期研究工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步關(guān)注nm23—H1在人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，擬闡明nm23—H1在母—胎界面促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞間交叉對(duì)話，及對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲行為的控制機(jī)制。 1、nm

3、23—H1在人早孕期母—胎界面的表達(dá) 目的：比較nm23—H1在正常和自然流產(chǎn)患者母—胎界面的表達(dá)。 方法：收集早孕期正常或不明原因自然流產(chǎn)的絨毛與蛻膜組織，采用RT—PCR、免疫組織化學(xué)、傳統(tǒng)免疫印跡法，分析母—胎界面nm23—H1表達(dá)特征，以比較nm23—H1在正常早孕與自然流產(chǎn)組之間的表達(dá)差異。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞中低度表達(dá)nm23—H1；蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)nm23—H1。從mRNA和蛋白水平分析

4、絨毛與蛻膜組織的nm23—H1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜nm23—H1表達(dá)水平明顯高于正常早孕期（P<0．05）。 結(jié)論：人早孕期母—胎界面過(guò)表達(dá)nm23—H1將導(dǎo)致妊娠失敗。 2、人母—胎界面nm23—H1的表達(dá)調(diào)控 目的：nm23—H1人在母—胎界面的表達(dá)調(diào)控。 方法：收集早孕期正常絨毛與蛻膜組織，對(duì)原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行多種干預(yù)，包括妊娠相關(guān)激素、炎性介質(zhì)及CsA處理，用In cell w

5、estern檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)。 結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用孕酮對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用；而17β—E2或生理濃度范圍β—hCG均可明顯下調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞nm23—H1表達(dá)； LPS不能引起滋養(yǎng)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)下調(diào)；CsA可降調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞nm23—H1的蛋白表達(dá)。 單獨(dú)使用孕酮、17β—E2或生理濃度范圍β—hCG，對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)無(wú)明顯影響；而給予高濃度β—hCG處理時(shí)，

6、nm23—H1表達(dá)較未處理組顯著下降；低劑量的LPS可以顯著下調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)，但此作用并非由炎性介質(zhì)IL-1β介導(dǎo)；CsA對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1無(wú)明顯調(diào)控作用。 結(jié)論：17β—E2、β—hCG下調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞nm23—H1蛋白水平，提示nm23—H1與正常妊娠有關(guān)。CsA也可以下調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞nm23—H1，提示CsA治療反復(fù)自然流產(chǎn)的新療效機(jī)制。高濃度β—hCG可降調(diào)節(jié)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)，提示在

7、滋養(yǎng)細(xì)胞疾病狀態(tài)下滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)分泌高水平β—hCG抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)，可能發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與侵襲。 3、nm23—H1參與調(diào)控人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力 目的：nm23—H1在人早孕母—胎界面的調(diào)節(jié)作用。 方法：采用胰酶消化、密度梯度離心法成功分離、培養(yǎng)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，建立直接或間接細(xì)胞共培養(yǎng)；使用siRNA干擾技術(shù)，成功干擾滋養(yǎng)細(xì)胞或蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1的表達(dá)，用Transw

8、ell法分析干擾nm23—H1后，滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)體系中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力；用In cell western法分析侵襲相關(guān)分子的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：干擾滋養(yǎng)細(xì)胞nm23—H1后，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力明顯增強(qiáng)，與侵襲相關(guān)的titin表達(dá)水平明顯上調(diào)；而MMP和TIMP表達(dá)則無(wú)明顯改變。干擾蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1后，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞titin及TIMP表達(dá)上調(diào)；而MMP活性無(wú)顯著差異。將干擾nm23—H1的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞與滋養(yǎng)

9、細(xì)胞共培養(yǎng)，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力亦明顯增強(qiáng)（P<0．05）。 結(jié)論：滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的nm23—H1可通過(guò)抑制titin表達(dá)而控制人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較高水平的nm23—H1，可限制滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度侵襲。 4、nm23—H1通過(guò)MAPK/ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力 目的：nm23—H1在人母—胎界面調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的信號(hào)通路。 方法：應(yīng)用siRNA干擾nm23—H1，然后

10、分析干擾后與侵襲相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路激活狀態(tài)。經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK1/2通路可能是其主要通路。為了驗(yàn)證nm23—H1調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力是否涉及MAPK/ERK1/2信號(hào)通路，將干擾nm23—H1的滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，分別加入信號(hào)通路阻斷劑U0126，進(jìn)行以下分組：si—negative、si—nm23—H1、si—negative+U0126和si—nm23—H1+U0126，用Transwell法研究滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，以

11、解析MAPK/ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)nm23—H1控制人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的可能機(jī)制；繼而用In cell western法分析各組與侵襲相關(guān)功能分子的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：經(jīng)干擾nm23—H1后，滋養(yǎng)細(xì)胞系和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)P/T—Erk水平明顯升高，并可被U0126完全抑制。通過(guò)DSC與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)（VCT/DSC）發(fā)現(xiàn)，無(wú)論干擾滋養(yǎng)細(xì)胞系，還是干擾蛻膜基質(zhì)細(xì)胞nm23—H1，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力均明顯升高；而U0126僅能部

12、分阻斷增高的侵襲性。提示nm23—H1通過(guò)抑制MAPK/ERK1/2信號(hào)通路降調(diào)節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。U0126能有效消除因干擾nm23—H1對(duì)titin的升調(diào)節(jié)作用。相關(guān)性回歸分析結(jié)果顯示，titin表達(dá)水平與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性呈正相關(guān)。因此，nm23—H1可以通過(guò)抑制MAKP/RK1/2信號(hào)通路，降調(diào)節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞或者蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)titin，并進(jìn)一步控制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性。 結(jié)論：nm23—H1通過(guò)抑制MAPK/ERK1