趨化因子CCL28在母-胎界面的表達及其調節(jié)作用.pdf

1、趨化因子是一類由67-127個氨基酸組成的細胞因子，通過與受體結合發(fā)揮多種生物學作用。一種趨化因子可以和一個或多個受體結合，一種趨化因子受體也可有多個趨化因子作為配體。通過配受體相互作用，構成了人體內復雜的趨化因子網絡，共同執(zhí)行著復雜的生物學功能。對趨化因子的功能的研究最初開始于炎癥;隨研究深入，人們發(fā)現趨化因子不僅具有趨化白細胞向炎癥局部游走的作用，還參與機體發(fā)育，腫瘤發(fā)生及進展等過程。我們課題組已經解析了CXCL12/CXCR4、C

2、XCL16/CXCR6和CCL2/CCR2在母-胎界面的生物學功能，及參與母-胎免疫調節(jié)的機制?；谀?胎界面可作為特化的粘膜局部，我們在此選擇了上皮性趨化因子CCL28及其受體CCR10，研究其在母-胎界面和母-胎免疫調節(jié)中的作用。
　　第一部分 CCL28在人早孕母-胎界面的表達及調控
　　目的：分析證實母-胎界面存在CCL28及其調控。
　　方法：收集人早孕期絨毛和蛻膜組織，采用免疫組織化學方法檢測CCL28在早

3、孕母-胎界面的表達。分離培養(yǎng)蛻膜基質細胞、蛻膜腺上皮細胞和滋養(yǎng)細胞，采用細胞免疫化學方法檢測CCL28的表達。采用RT-PCR、In-cell western和流式細胞術進一步證實CCL28在蛻膜基質細胞的表達。對原代培養(yǎng)的蛻膜基質細胞，用促炎性細胞因子或雌、孕激素處理，研究這些因素對CCL28表達的調控作用。
　　結果：早孕絨毛和蛻膜組織均能檢測到CCL28的表達。原代培養(yǎng)的蛻膜基質細胞、蛻膜腺上皮細胞和滋養(yǎng)細胞均表達CCL28

4、。RT-PCR和In-cell western進一步證實了CCL28在蛻膜基質細胞的表達，流式細胞術結果顯示90％以上的蛻膜基質細胞表達CCL28。促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-17A上調CCL28的表達。雌激素和孕激素對CCL28的表達無影響。
　　結論：母-胎界面可表達CCL28，促炎性細胞因子上調CCL28在蛻膜基質細胞的表達。
　　第二部分 CCL28對蛻膜基質細胞生物學行為的調節(jié)作用

5、>　　目的：檢測蛻膜基質細胞CCL28受體CCR10和CCR3的表達，解析其對蛻膜基質細胞生物學行為的調節(jié)作用。
　　方法：流式細胞術分析來自正常早孕和不明原因復發(fā)性流產的蛻膜基質細胞的CCR10和CCR3的表達。CCK8法研究CCL28對蛻膜基質細胞增殖和活力的影響，侵襲實驗檢測CCL28對蛻膜基質細胞侵襲能力的影響，AnnexinⅤ和PI染色后流式分析CCL28對蛻膜基質細胞凋亡的作用。細胞因子處理蛻膜基質細胞后，流式細胞術分

6、析CCR10和CCR3在蛻膜基質細胞的表達。ELISA比較正常和不明原因復發(fā)性流產的蛻膜基質細胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌。
　　結果：不明原因復發(fā)性流產蛻膜基質細胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌水平高于正常蛻膜基質細胞。不明原因復發(fā)性流產蛻膜基質細胞的CCR10和CCR3的表達均高于正常蛻膜基質細胞。CCL28對蛻膜基質細胞的增殖和活力無影響;通過其受體CCR10和CCR3促進蛻膜基質細胞的侵襲，

7、CCL28主要通過CCR3受體促進DSC的凋亡。IL-1β、TNF-α和IL-17A上調蛻膜基質細胞的CCR10表達，IL-1β和IL-17A都能上調蛻膜基質細胞CCR3的表達。
　　結論:自然流產蛻膜基質細胞的CCR10和CCR3的表達上調，增加了其對CCL28的敏感性。CCL28通過CCR10和CCR3促進蛻膜基質細胞的侵襲，通過CCR3誘導蛻膜基質細胞凋亡。不明原因復發(fā)性流產蛻膜的蛻膜基質細胞的IL-1β、TNF-α和IL-

8、17A的分泌水平高于正常蛻膜基質細胞。促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-17A促進蛻膜基質細胞的CCR10表達。IL-1β和TNF-α上調蛻膜基質細胞的CCR3的表達。
　　第三部分人早孕蛻膜CCR10+ Treg功能表型
　　目的:分析人早孕蛻膜CCR10+Treg表型。
　　方法:流式細胞術檢測外周和蛻膜局部CCR10+Treg的存在。比較分析正常蛻膜和復發(fā)性流產蛻膜的CCR10+Treg百分比。流式細胞

9、術比較分析蛻膜CCR10+Treg和CCR10-Treg的表型。
　　結果:外周和蛻膜均存在CCR10+Treg，占總Treg10％左右。自然流產的CCR10+Treg占總Treg的百分比增加。與CCR10-Treg比較，CCR10+Treg高表達CTLA4、TGF-β1、IL-10、CD45RA、CCR7、CXCR3、CXCR6、CD103、CD29和αVβ5，低表達CXCR4。蛻膜CCR10+ Treg的Foxp3的表達低于C

10、CR10-Treg。
　　結論:蛻膜存在CCR10+ Treg，自然流產的蛻膜CCR10+ Treg比例升高。與CCR10-Treg相比，CCR10+ Treg具備獨特的表型特征: CTLA4、TGF-β1、IL-10、CD45RA、CCR7、CXCR7、CXCR6、CD103、CD29和αVβ5高表達，CXCR4和Foxp3低表達。
　　第四部分 CCL28對CCR10+Treg的募集和調節(jié)作用
　　目的:探討CCL

11、28對Treg的趨化作用，SDF-1對CCR10+Treg的趨化能力及CCL28對Treg的Foxp3、CCR10和CCR3的表達調節(jié)。
　　方法:流式細胞術檢測并比較外周和蛻膜Treg的趨化因子受體表達譜。趨化實驗分析CCL28對Treg的募集能力，SDF-1對CCR10+Treg的趨化能力。體外分離并擴增Treg，采用rhCCL28進行處理，流式細胞術分析Foxp3、CCR10、CCR3、CD39和CTLA4的表達。
　

12、　結果:除了CCR10和CCR3，外周Treg和蛻膜Treg還高表達CCR4、CXCR4和CXCR6，蛻膜Treg的CCR5、CCR6、CCR9、CXCR1、CXCR2和CXCR3的表達水平高于外周Treg。CCL28具備趨化募集Treg的能力，SDF-1募集Treg，以募集CCR10-Treg為主。CCL28降調節(jié)Treg的Foxp3的表達，促進Treg的CCR10和CCR3的表達;對CD39和CTLA4的表達無明顯影響。