趨化因子CCL28在母-胎界面的表達(dá)及其調(diào)節(jié)作用.pdf

1、趨化因子是一類由67-127個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞因子，通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)作用。一種趨化因子可以和一個(gè)或多個(gè)受體結(jié)合，一種趨化因子受體也可有多個(gè)趨化因子作為配體。通過(guò)配受體相互作用，構(gòu)成了人體內(nèi)復(fù)雜的趨化因子網(wǎng)絡(luò)，共同執(zhí)行著復(fù)雜的生物學(xué)功能。對(duì)趨化因子的功能的研究最初開(kāi)始于炎癥;隨研究深入，人們發(fā)現(xiàn)趨化因子不僅具有趨化白細(xì)胞向炎癥局部游走的作用，還參與機(jī)體發(fā)育，腫瘤發(fā)生及進(jìn)展等過(guò)程。我們課題組已經(jīng)解析了CXCL12/CXCR4、C

2、XCL16/CXCR6和CCL2/CCR2在母-胎界面的生物學(xué)功能，及參與母-胎免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制?；谀?胎界面可作為特化的粘膜局部，我們?cè)诖诉x擇了上皮性趨化因子CCL28及其受體CCR10，研究其在母-胎界面和母-胎免疫調(diào)節(jié)中的作用。
　　第一部分 CCL28在人早孕母-胎界面的表達(dá)及調(diào)控
　　目的：分析證實(shí)母-胎界面存在CCL28及其調(diào)控。
　　方法：收集人早孕期絨毛和蛻膜組織，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CCL28在早

3、孕母-胎界面的表達(dá)。分離培養(yǎng)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜腺上皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)CCL28的表達(dá)。采用RT-PCR、In-cell western和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)CCL28在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。對(duì)原代培養(yǎng)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，用促炎性細(xì)胞因子或雌、孕激素處理，研究這些因素對(duì)CCL28表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：早孕絨毛和蛻膜組織均能檢測(cè)到CCL28的表達(dá)。原代培養(yǎng)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜腺上皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞均表達(dá)CCL28

4、。RT-PCR和In-cell western進(jìn)一步證實(shí)了CCL28在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示90％以上的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CCL28。促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-17A上調(diào)CCL28的表達(dá)。雌激素和孕激素對(duì)CCL28的表達(dá)無(wú)影響。
　　結(jié)論：母-胎界面可表達(dá)CCL28，促炎性細(xì)胞因子上調(diào)CCL28在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
　　第二部分 CCL28對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用

5、>　　目的：檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CCL28受體CCR10和CCR3的表達(dá)，解析其對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)自正常早孕和不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的CCR10和CCR3的表達(dá)。CCK8法研究CCL28對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和活力的影響，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCL28對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞侵襲能力的影響，AnnexinⅤ和PI染色后流式分析CCL28對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞因子處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)分

6、析CCR10和CCR3在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。ELISA比較正常和不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌。
　　結(jié)果：不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌水平高于正常蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的CCR10和CCR3的表達(dá)均高于正常蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。CCL28對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和活力無(wú)影響;通過(guò)其受體CCR10和CCR3促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的侵襲，

7、CCL28主要通過(guò)CCR3受體促進(jìn)DSC的凋亡。IL-1β、TNF-α和IL-17A上調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的CCR10表達(dá)，IL-1β和IL-17A都能上調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CCR3的表達(dá)。
　　結(jié)論:自然流產(chǎn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的CCR10和CCR3的表達(dá)上調(diào)，增加了其對(duì)CCL28的敏感性。CCL28通過(guò)CCR10和CCR3促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的侵襲，通過(guò)CCR3誘導(dǎo)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的IL-1β、TNF-α和IL-

8、17A的分泌水平高于正常蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-17A促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的CCR10表達(dá)。IL-1β和TNF-α上調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的CCR3的表達(dá)。
　　第三部分人早孕蛻膜CCR10+ Treg功能表型
　　目的:分析人早孕蛻膜CCR10+Treg表型。
　　方法:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周和蛻膜局部CCR10+Treg的存在。比較分析正常蛻膜和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜的CCR10+Treg百分比。流式細(xì)胞

9、術(shù)比較分析蛻膜CCR10+Treg和CCR10-Treg的表型。
　　結(jié)果:外周和蛻膜均存在CCR10+Treg，占總Treg10％左右。自然流產(chǎn)的CCR10+Treg占總Treg的百分比增加。與CCR10-Treg比較，CCR10+Treg高表達(dá)CTLA4、TGF-β1、IL-10、CD45RA、CCR7、CXCR3、CXCR6、CD103、CD29和αVβ5，低表達(dá)CXCR4。蛻膜CCR10+ Treg的Foxp3的表達(dá)低于C

10、CR10-Treg。
　　結(jié)論:蛻膜存在CCR10+ Treg，自然流產(chǎn)的蛻膜CCR10+ Treg比例升高。與CCR10-Treg相比，CCR10+ Treg具備獨(dú)特的表型特征: CTLA4、TGF-β1、IL-10、CD45RA、CCR7、CXCR7、CXCR6、CD103、CD29和αVβ5高表達(dá)，CXCR4和Foxp3低表達(dá)。
　　第四部分 CCL28對(duì)CCR10+Treg的募集和調(diào)節(jié)作用
　　目的:探討CCL

11、28對(duì)Treg的趨化作用，SDF-1對(duì)CCR10+Treg的趨化能力及CCL28對(duì)Treg的Foxp3、CCR10和CCR3的表達(dá)調(diào)節(jié)。
　　方法:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并比較外周和蛻膜Treg的趨化因子受體表達(dá)譜。趨化實(shí)驗(yàn)分析CCL28對(duì)Treg的募集能力，SDF-1對(duì)CCR10+Treg的趨化能力。體外分離并擴(kuò)增Treg，采用rhCCL28進(jìn)行處理，流式細(xì)胞術(shù)分析Foxp3、CCR10、CCR3、CD39和CTLA4的表達(dá)。
　

12、　結(jié)果:除了CCR10和CCR3，外周Treg和蛻膜Treg還高表達(dá)CCR4、CXCR4和CXCR6，蛻膜Treg的CCR5、CCR6、CCR9、CXCR1、CXCR2和CXCR3的表達(dá)水平高于外周Treg。CCL28具備趨化募集Treg的能力，SDF-1募集Treg，以募集CCR10-Treg為主。CCL28降調(diào)節(jié)Treg的Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)Treg的CCR10和CCR3的表達(dá);對(duì)CD39和CTLA4的表達(dá)無(wú)明顯影響。