阿司匹林對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與功能及其iNOS的影響.pdf

1、目的：血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，這些內(nèi)皮祖細(xì)胞來(lái)自于骨髓中的前體細(xì)胞。新近研究表明，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機(jī)體的骨髓及外周血，在成體血管新生中起重要作用。近年來(lái)的研究表明EPCs在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少預(yù)示血管內(nèi)皮修復(fù)能力降低，心血管疾病發(fā)生率增高。阿司匹林(aspirin)廣泛用于心血管疾病的防

2、治，為重要的非甾體抗炎藥，主要通過(guò)抑制環(huán)氧化酶而抑制花生四烯酸的代謝，減少前列腺素的合成，抑制炎癥、抑制血小板聚集。大量臨床研究證實(shí)，阿司匹林可減少與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)疾病的發(fā)生。一氧化氮(NO)由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)合成，是細(xì)胞中重要的信號(hào)分子。本文旨在研究阿司匹林對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量及增殖能力、遷移能力、黏附能力和體外血管形成能力的影響，并探討阿司匹林對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞中iNOS的影響。 方法：實(shí)驗(yàn)血液樣本來(lái)自6位健康志愿者

3、，每份血液完成一組實(shí)驗(yàn)，包括對(duì)照組和藥物干預(yù)組的EPCs數(shù)量及功能檢測(cè)。采用密度梯度離心法從外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上。M199培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d，用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。貼壁細(xì)胞隨機(jī)分成15組，每組6孔，1-5組為對(duì)照組，為正常培養(yǎng)組，分別培養(yǎng)0、3、6、12、24h；6-10組分別加入含阿司匹林0、1、2、5、10mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)

4、基培養(yǎng)24h；11-15組為阿司匹林5mmol/L組分別培養(yǎng)0、3、6、12、24h。激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-Ⅰ和Dil-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs，將其在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。然后分別采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)和體外血管形成試劑盒來(lái)觀察EPCs的增殖能力、遷移能力、黏附能力和體外血管形成能力，免疫印跡雜交法(Westernblot)半定量測(cè)定iNOS含量。 結(jié)果：

5、1.EPCs的鑒定分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-Ⅰ對(duì)細(xì)胞染色后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ和Dil-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs，在倒置熒光顯微鏡下(×200)計(jì)數(shù)15個(gè)隨機(jī)選擇視野的EPCs。 2.阿司匹林對(duì)外周血EPCs數(shù)量的影響不同濃度的阿司匹林與EPCs培養(yǎng)24h顯示阿司匹林能減少EPCs數(shù)量，并且EPCs數(shù)量隨阿司匹林濃

6、度增加而降低；在5mmol/L組中亦可見(jiàn)EPCs數(shù)量隨阿司匹林作用時(shí)間增加而降低。 3.阿司匹林對(duì)外周血EPCs增殖功能的影響采用MTT比色法檢測(cè)阿司匹林對(duì)EPCs增殖能力的影響，結(jié)果顯示：阿司匹林顯著降低EPCs的增殖能力，呈一定的量效關(guān)系。在5mmol/L阿司匹林組中呈時(shí)間依賴(lài)性降低EPCs的增殖能力。 4.阿司匹林對(duì)外周血EPCs遷移功能的影響采用改良的Boyden小室檢測(cè)阿司匹林對(duì)EPCs遷移能力的影響，在200

7、倍顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。阿司匹林明顯降低了EPCs的遷移能力，且EPCs的遷移能力下降呈作用濃度和時(shí)間依賴(lài)性。 5.阿司匹林對(duì)外周血EPCs黏附功能的影響為了觀察阿司匹林對(duì)外周血EPCs黏附能力的影響，先將不同濃度的阿司匹林與EPCs培養(yǎng)24h，然后將相同數(shù)量的EPCs重新接種到包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板上培養(yǎng)30min，結(jié)果顯示阿司匹林明顯降低了EPCs的黏附能力，且EPCs的黏附能力下降呈阿司匹林作用濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

8、 6.阿司匹林對(duì)外周血EPCs體外血管形成能力的影響體外血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿司匹林明顯抑制EPCs的體外血管形成能力，其抑制作用呈濃度依賴(lài)性。 7.阿司匹林對(duì)外周血EPCs中iNOS表達(dá)的影響采用免疫印跡雜交法獲得iNOS條帶，顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描，半定量分析顯影條帶。阿司匹林降低了EPCs的iNOS，且EPCs的iNOS下降呈阿司匹林濃度和時(shí)間依賴(lài)性。 結(jié)論：1.可以從外周血中的單個(gè)核細(xì)胞分離和培養(yǎng)血管內(nèi)