低氧對外周血內(nèi)皮祖細胞功能的影響及機制探討.pdf

1、越來越多的證據(jù)表明損傷器官的修復(fù)不僅包括受損部位鄰近細胞的增值和遷移還包括其他部位干細胞的參與。內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一類能增殖并分化為血管肉皮細胞的前提細胞，其特征性的表達CD34、KDR及CD133。研究表明EPCs在缺血組織的血管新生(revascularizatioa)及受損血管的再內(nèi)皮化(re-endothelialization)中起到了重要的作用。當(dāng)受到如缺血組織釋放

2、的各種細胞因子的刺激，內(nèi)皮祖細胞從骨髓進入血液循環(huán)(mobilization)，到達需要組織修復(fù)的部位或受損血管(homing)分化成為內(nèi)皮細胞(differentiation)，并釋放多種可以促進局部內(nèi)皮細胞的遷移和增殖的細胞因子。EPCs移植在心血管疾病治療中有廣泛的應(yīng)用前景，其可以改善心肌梗死患者的心功能，減少心肌重塑，增加下肢缺血病人的運動耐量。 低氧與心絞痛，心肌梗死，心力衰竭及外周動脈疾病密切相關(guān)，低氧和組織缺血多由

3、于血管閉塞或由于高血壓所致功能及解剖性微血管稀疏所致。降低的氧濃度刺激機體產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，例如內(nèi)皮細胞的增殖，血管生成(angiogenesis)等，從而緩解局部缺氧。為適應(yīng)低氧刺激，細胞內(nèi)多種信號分子被激活，其中低氧誘導(dǎo)分子(Hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)是細胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的關(guān)鍵信號分子。晚近研究表明，低氧微環(huán)境(如缺血組織，受損血管)通過HIF-1路徑刺激局部細胞釋放內(nèi)皮生長因子(Vascular

4、endothelialgrowthfactor，VEGF)及基質(zhì)細胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor-1α，SDF-1α)從而促進EPCs的動員及歸巢。但低氧微環(huán)境對EPCs遷移及凋亡的影響，目前還不清楚。 基于上述理論，我們提出假設(shè)：低氧可以影響EPCs的功能，繼而影響受損血管內(nèi)皮修復(fù)能力及血管生成，進而影響一系列心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前國內(nèi)外有關(guān)低氧對EPCs功能的影響及其機制的研究尚很

5、少。為此，我們首先觀察了體外低氧對外周血EPCs功能的影響，隨后進一步探討了低氧影響EPCs功能的可能機制。以下分兩部分對本研究的方法、結(jié)果以及結(jié)論作一簡述。 第一部分低氧對外周血內(nèi)皮祖細胞功能的影響 目的： 觀察體外低氧對外周血EPCs功能的影響。 方法： 采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個核細胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d，細胞同步化后放入低氧微環(huán)境(2％O2)干預(yù)。多波

6、長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs，流式細胞儀檢測其表面標(biāo)志進一步鑒定EPCs。采用改良的Boyden小室、MTT比色法、FITC-AnnexinV/PI流式細胞儀檢測、TUNEL染色法分別觀察EPCs的遷移能力、細胞活力和細胞凋亡情況。 結(jié)果： 低氧24h能顯著增強外周血EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力。去血清48h，EPCs細胞活力明顯

7、下降，細胞凋亡明顯增多，低氧24h可以延緩去血清誘導(dǎo)的細胞活力降低，抑制去血清誘導(dǎo)的EPCs凋亡(與對照組比較，遷移能力58.57±10.49vs38.57±7.48，細胞活力0.74±0.13vs0.62±0.09，凋亡情況27.87％±2.03％vs32.43％±3.11％). 結(jié)論： 低氧可增強EPCs遷移能力，抑制EPCs活力下降及凋亡。 第二部分低氧對內(nèi)皮祖細胞功能影響的機制探討 目的：

8、 研究低氧增強EPCs遷移及抑制其凋亡的機制。 方法： 采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個核細胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiIacLDL雙染色陽性細胞為EPCs，流式細胞儀檢測其表面標(biāo)志進一步鑒定EPCs。培養(yǎng)7d后，細胞同步化后，EPCs低氧培養(yǎng)24h干預(yù)或先予以磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)、

9、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellularsignalregulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)抑制劑預(yù)處理1h后干預(yù)，RT-PCR檢測SDF-1α受體CXCR4mRNA的表達；流式細胞儀測定CXCR4表達率、改良的Boyden小室測量EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力。FITC-AnnexinV/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡。Westernblot檢測EPCsAkt、ERK1/2、GSK-3β

10、(Glycogensynthasekinase-3β)磷酸化水平及HIF-1α蛋白水平。采用MTT比色法觀察EPCs的活力。 結(jié)果： 低氧24h，EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力明顯增強，SDF-1α受體CXCR4mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組，CXCR4特異性阻斷劑AMD3100和PI3K抑制劑(LY294002)可以近乎完全抑制增強的遷移能力，并且后者可以明顯抑制低氧誘導(dǎo)的CXCR4表達增高

11、，而ERK1/2抑制荊(PD98059)則對CXCR4的表達及EPCs的遷移能力沒有明顯作用。研究還發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑(LY294002)可以近乎完全的抵消低氧抑制的去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的EPCs活力下降及凋亡，而PD98059則無明顯作用。Westernblot檢測顯示低氧可以促進EPCsAkt、ERK1/2、GSK-3β的磷酸化和HIF-1α蛋白水平的增加。 結(jié)論： 低氧可增加EPCs受體CXCR4的表達，抑制EPCs凋亡