胸腺素β4對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及機(jī)制探討.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，但尚來完全表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型。EPCs兼具造血干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的部分表面標(biāo)志，如CD34、CD133、VEGFR-2等。大量研究表明，EPCs在缺血組織的血管新生、損傷血管的再內(nèi)皮化、內(nèi)皮功能障礙的逆轉(zhuǎn)等方面扮演重要角色，因而在心血管系統(tǒng)的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。然而，多種冠心病危險(xiǎn)因素諸如老齡、吸煙、

2、高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病等會(huì)使循環(huán)EPCs的功能受損，從而限制了基于EPCs的細(xì)胞治療手段在臨床中的應(yīng)用。因此，探求有效途徑增強(qiáng)EPCs功能至關(guān)重要。 胸腺素(thymosins)是一類多肽分子，最初從小牛胸腺中提取得到，根據(jù)其等電點(diǎn)的不同而分為三個(gè)亞家族(α，β和γ亞家族)。胸腺素β4( thymosinβ4，Tβ4)是胸腺素β家族中的一員，由43個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛分布于人體內(nèi)多種組織與細(xì)胞中。Tβ4介導(dǎo)了多種生物學(xué)反

3、應(yīng)，如血管新生、創(chuàng)傷愈合等。此前研究表明，Tβ4增強(qiáng)多種干/祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化等功能，進(jìn)而促進(jìn)血管新生及心肌修復(fù)。但是，目前尚未明確Tβ4是否可通過增強(qiáng)循環(huán)EPCs的功能而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。 基于上述理論基礎(chǔ)，我們提出假設(shè)：Tβ4能增強(qiáng)EPCs的功能，促進(jìn)其修復(fù)血管內(nèi)皮，維持內(nèi)皮的完整性，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。由于目前對(duì)Tβ4影響EPCs的功能及其機(jī)制方面知之甚少，我們首先觀察了Tβ4對(duì)EPCs增殖、遷移、粘附等功能的

4、影響，并探討了可能參與其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，然后觀察了Tβ4對(duì)EPCs凋亡及衰老的作用。以下分三部分對(duì)本研究的方法、結(jié)果及結(jié)論作一簡(jiǎn)述。 1、胸腺素β4對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響 目的： 觀察Tβ4體外干預(yù)對(duì)外周血EPCs功能的影響 方法： 采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，收集貼壁細(xì)胞，予FITC- UEA-I及Dil-acLDL染色，

5、激光共聚焦顯微鏡下觀察，雙染色陽性細(xì)胞鑒定為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志(VEGFR-2，CD34，CD133)，進(jìn)一步鑒定EPCs。加入不同濃度Tβ4(1ng/mL10ng/mL，100ng/mL和1000ng/mL)干預(yù)，并進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。分別采用MTT比色法、集落形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀察EPCs的增殖能力、集落形成能力、遷移能力和粘附能力。 結(jié)果： Tβ4能明顯

6、增加EPCs的增殖、集落形成、遷移和粘附能力，并呈一定的量效關(guān)系，在1000ng/mL組達(dá)到最大效應(yīng)(與對(duì)照組比較，增殖能力0.409±0.020 vs0.257±0.015，P<0.05；集落形成能力16.7±2.6 vs6.0±1.0，P<0.05；遷移能力79.6±5.6 vs31.5±3.4，P<0.05；粘附能力45.3±4.7 vs18.8±3.0，P<0.05)。 結(jié)論： Tβ4可增強(qiáng)EPCs的功能，且Tβ

7、4對(duì)EPCs功能的影響呈一定的量效關(guān)系。 2、胸腺素β4影響外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制探討 目的： 觀察Tβ4影響外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 方法： 采用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，收集貼壁細(xì)胞，予FITC-UEA-I及Dil-acLDL染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，雙染色陽性細(xì)胞鑒定為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其

8、表面標(biāo)志( VEGFR-2，CD34，CD133)，進(jìn)一步鑒定EPCs。加入Tβ4干預(yù)，western blot檢測(cè)EPCs Akt Ser473、eNOS Ser1177和ERK1/2的磷酸化水平。隨后，在分別加入磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kmase，PI3K)抑制劑、內(nèi)皮型一氧化氮合酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抑制劑、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ex

9、tracellular signal-regulated protein kinase，ERK)1/2抑制劑預(yù)處理EPCs30min后，再予1000ng/mL Tβ4干預(yù)，采用MTT比色法、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)分別觀察EPCs的增殖能力、遷移能力和粘附能力。 結(jié)果： Western blot檢測(cè)顯示Tβ4能促進(jìn)Akt Ser473、eNOS Ser1177和ERK1/2的磷酸化，且均呈一定的時(shí)效和

10、量效關(guān)系。PI3K抑制劑(LY294002，Wortmannin)及eNOS抑制劑(L-NAME)均顯著抑制了Tβ4促進(jìn)EPCs增殖、遷移和粘附的作用，而ERK1/2抑制劑(PD98059)則均無明顯影響。 結(jié)論： PI3K/Akt/eNOS而非ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與對(duì)Tβ4促進(jìn)EPCs增殖、遷移、粘附的調(diào)控。 3胸腺素β4對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡和衰老的影響 目的： 觀察Tβ4對(duì)外周血內(nèi)皮祖

11、細(xì)胞凋亡和衰老的影響 方法： 采用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，收集貼壁細(xì)胞，予FITC-UEA-I及DiI-acLDL染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，雙染色陽性細(xì)胞鑒定為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志( VEGFR-2，CD34，CD133)，進(jìn)一步鑒定EPCs。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)7d后，采用去血清培養(yǎng)以誘導(dǎo)EPCs凋亡。在去血清培養(yǎng)EPCs24h后加入不

12、同濃度Tβ4(1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL和1000ng/mL)干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，Alexa Fluor()488-Annexin V/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)4d后，加入不同濃度Tβ4(1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL)干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)7d后，采用SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老。 結(jié)果： Tβ4能明顯抑制EPCs的凋亡和衰老，且均呈一定的