枯草芽孢桿菌谷氨酰t-RNA還原酶基因（hemA）和谷氨酰t-RNA合成酶基因（hemL）表達(dá)載體的構(gòu)建及優(yōu)化.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，簡(jiǎn)稱ALA)是生物合成四吡咯的前體，而四吡咯是構(gòu)成生物體必不可少的物質(zhì)。ALA對(duì)人畜無(wú)毒性，在環(huán)境中易降解、無(wú)殘留，是一種無(wú)公害的綠色農(nóng)用化學(xué)品。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，ALA可作為抗癌藥物的中間體，作為檢驗(yàn)鉛中毒的主要試劑。1999年12月，美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)ALA為治療皮膚癌前期的光動(dòng)力藥物，ALA在治療其它表皮癌癥中的應(yīng)用也得到了越來(lái)越多科學(xué)家的興趣。作為第二代光動(dòng)力藥，ALA的顯

2、著優(yōu)點(diǎn)是副作用小、滲透性好、療效確切、對(duì)疾病的適用范圍廣及價(jià)格低等。 本研究以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(M57676)的枯草芽抱桿菌基因組中的hemA和hemL基因序列為模板設(shè)計(jì)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到hemA和hemL基因片段，并克隆到pGEM-T-Vector載體上，得到重組質(zhì)粒pGEM-T-hemA和pGEM-T-hemL。酶切回收hemA和hemL基因片段并克隆到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體(pGJ113)的Pglv啟動(dòng)子下

3、游EcoRI和Not1位點(diǎn)間，構(gòu)建hemA和hemL基因的表達(dá)載體pGJ216和pGJ218。將兩個(gè)表達(dá)載體分別電轉(zhuǎn)化至B.subtilis 1A747感受態(tài)細(xì)胞中，用麥芽糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠掃描分析顯示，目標(biāo)蛋白HemA和HemL分別占胞內(nèi)總可溶性蛋白的11％和13％，實(shí)現(xiàn)了hemA和hemL基因的高效表達(dá)。重組菌B.subtilis(pGJ216)和B. subtilis(pGJ218)的發(fā)酵液上清中5-氨基乙酰丙酸

4、含量分別達(dá)到26.31 mg/L和24.47mg/L，菌液呈紅色，紫外分光光度檢測(cè)驗(yàn)證顯色的為卟啉類物質(zhì)。試驗(yàn)表明，表達(dá)的重組蛋白具有生理活性并促進(jìn)了枯草芽孢桿菌中5-氨基乙酰丙酸的合成，并且分解代謝途徑也加快。 對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體pGJ216和pGJ218進(jìn)行優(yōu)化，將突變的Pglv啟動(dòng)子-PglvM分別克隆到pGJ216和pGJ218中hemA和hemL基因的上游，替換Pglv啟動(dòng)子，得到表達(dá)載體pGJ216M和pGJ218M，

5、將其電轉(zhuǎn)化至B. subtilis 1A747感受態(tài)細(xì)胞中，用麥芽糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析顯示，pGJ216M和pGJ218M的表達(dá)蛋白在50 KD附近有一條明顯的條帶，而對(duì)照菌沒(méi)有明顯的蛋白條帶，結(jié)果表明得到較大量的谷氨酰t-RNA還原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白，并且在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。優(yōu)化后的表達(dá)載體pGJ216M和pGJ218M比表達(dá)載體pGJ216和pGJ218的誘導(dǎo)表達(dá)效果更好，生成的5-氨