枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的克隆及表達(dá).pdf

1、本論文主要研究了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)，并將該基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，實(shí)現(xiàn)了該酶的分泌表達(dá)。對大腸桿菌BL21/pET-tg的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，對純化后的重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)作了初步研究，
　　 以枯草芽孢桿菌DB104染色體DNA為模板，利用PCR技術(shù)成功地擴(kuò)增得到谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因（tg），并與大腸桿菌載體pET-22b（+）相連，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-tg。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-tg轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL2

2、1（DE3）中，構(gòu)建重組菌BL21/pET-tg，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。表達(dá)產(chǎn)物以可溶性和包涵體兩種形式存在，酶活為1950 U/g（DCW）。
　　 以重組質(zhì)粒pET-tg為模板，PCR擴(kuò)增谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因（tg），將其與枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pWB980相連，構(gòu)建了枯草芽孢桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pWBTG。采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將重組表達(dá)質(zhì)粒pWBTG轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌DB104中，構(gòu)建重組菌DB104/pWBTG，

3、實(shí)現(xiàn)了該基因的分泌表達(dá)，培養(yǎng)24h后酶活達(dá)到318 U/g（DCW）。
　　 對大腸桿菌BL21/pET-tg的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果為：當(dāng)OD600為1.2左右時，添加IPTG至終濃度為0.2mmol/L，同時溫度降至25℃開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間為5h。優(yōu)化后產(chǎn)物絕大部分以可溶形式存在，酶活由1590U/g（DCW）提高到2200U/g（DCW），比優(yōu)化前提高了的38％。
　　 采用Ni2+親和柱對重組菌BL21/pET