轉(zhuǎn)谷氨酰酶基因的克隆表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、素有“超級(jí)粘合劑”之稱的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為一種新型的食品添加劑，大大改善了蛋白質(zhì)的功能特性，對(duì)開發(fā)新型食品和提高產(chǎn)品品質(zhì)具有積極的促進(jìn)作用，應(yīng)用前景十分廣闊。但是，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶到目前為止并沒(méi)有在中國(guó)的食品工業(yè)中得到廣泛的推廣應(yīng)用，主要原因在于：1進(jìn)口轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶價(jià)格昂貴，使用它將大大提高食品的生產(chǎn)成本：2國(guó)內(nèi)使用的產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶菌株產(chǎn)酶量較低，酶活也不高，生產(chǎn)成本較為昂貴。為了獲得能夠高產(chǎn)的基因工程菌，首先需要獲得產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的野生菌。

2、
　　 本實(shí)驗(yàn)利用簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)交聯(lián)凝絮-沉淀性能測(cè)定試驗(yàn)進(jìn)行初篩，最終獲得一株酶活達(dá)到0.47U/ml的野生菌株，經(jīng)生理生化及16SrDNA鑒定后屬于放線菌綱的鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)。然后擴(kuò)增出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，以獲得高產(chǎn)的重組轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶菌株的篩選。采集了多份土壤，為了避免在菌種初篩過(guò)程中就直接測(cè)定MTG活性而需要大量使用價(jià)格昂貴

3、的酶作用底物CBZ-G1n-GLy，節(jié)省時(shí)間精力和經(jīng)費(fèi)開支，采用蛋白質(zhì)交聯(lián)凝絮-沉淀性能測(cè)定試驗(yàn)進(jìn)行初篩，然后復(fù)篩時(shí)在測(cè)定酶活，篩選出活性相對(duì)較高的菌株St4，酶活達(dá)到0.47U/ml。
　　 2.菌株的鑒定。根據(jù)菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析等進(jìn)行多項(xiàng)分類鑒定研究，初步鑒定出St4為放線菌類鏈霉菌屬中的吸水鏈霉菌。
　　 3.MTG基因的擴(kuò)增。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，首先擴(kuò)增出含活性中心的中心序列，然

4、后用sitefinding-PCR分別擴(kuò)增出上下游序列，完成對(duì)MTG全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增。吸水鏈霉菌st4的MTG基因編碼區(qū)總長(zhǎng)為1251bp，與已公布來(lái)源的吸水鏈霉菌推測(cè)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列EU477523比較，有214個(gè)堿基的差異，核苷酸序列的同源性為83％，第149位氨基酸Cys為活性中心位點(diǎn)，成熟酶分子中催化三聯(lián)體為Cys149-His359-ASp346與其它鏈霉菌來(lái)源的同源酶一致。
　　 4.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)

5、化。將MTG基因與大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體pET-23(a)和pET-32(a)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-23(a)-MTG和pET-32(a)-MTG，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。使用SDS-PAGE電泳、酶活測(cè)定的檢測(cè)證明MTG的正確表達(dá)，接著對(duì)重組酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果表明：該轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶重組菌在pH6.5的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至2.5h時(shí)，加入IPTG至終濃度為75μg/mL，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h酶活達(dá)到10.23U