16S rRNA等相關基因快速檢測幽門螺桿菌及其毒力的多重基因定量分析系統(tǒng)的建立與應用.pdf

1、目的：
　　1.設計針對H.pylori菌種特異性及其毒力相關基因位點的引物，建立H.pylori鑒定、毒力相關基因的25重體系的多重基因分析系統(tǒng)。
　　2.評估H.pylori多重基因分析系統(tǒng)檢測幽門螺桿菌的靈敏度和特異度。
　　3.利用H.pylori單拷貝基因ureC基因建立標準定量曲線，建立H.pylori定量分析系統(tǒng)。
　　方法：
　　1.建立H.pylori鑒定、毒力相關基因的25重體系的多重基

2、因分析系統(tǒng)
　　在NCBI數(shù)據(jù)庫獲取25種鑒定和毒力相關基因的原始序列，利用NCBI-Primer、Primer3.0、Premier Primer5.0三種引物設計工具針對每種基因設計多對引物。利用H.pylori標準菌株NCTC11637和悉尼SS1的DNA模版反復驗證所設計引物的有效性，同時不斷改變多重PCR的反應條件（主要是退火溫度），最后摸索出25對引物的最佳組合以及最佳反應條件，減少引物之間的競爭，抑制非特異擴增，最終

3、使每對引物都能夠有效表達。
　　2.評估多重基因分析系統(tǒng)靈敏度和特異度
　　構建載體，建立10倍濃度梯度，拷貝數(shù)分別為10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108，針對每個拷貝數(shù)看多重基因分析系統(tǒng)是否有目的擴增信號來評估其靈敏度。利用大腸埃希菌標準菌株ATCC25922、銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853、乙肝病毒標準質(zhì)控品、水作為陰性模版作為陰性對照體系，引物為25對上述針對

4、H.pylori設計的引物，根據(jù)是否有擴增信號來評估該多重PCR系統(tǒng)的特異度。
　　3.利用H.pylori單拷貝基因ureC基因建立標準定量曲線，建立H.pylori定量分析系統(tǒng)。
　　構建載體，建立10倍濃度梯度，拷貝數(shù)分別為1、10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108，根據(jù)每個拷貝梯度所得出的目的峰面積，利用Curve expert統(tǒng)計軟件建立拷貝數(shù)與峰面積之間的函數(shù)關系

5、。
　　結果：
　　1.H.pylori鑒定、毒力相關基因的25重體系的多重基因分析系統(tǒng)的建立
　　通過對引物和反應條件的反復優(yōu)化，最終使4對重要的鑒定基因（16SrRNA、ureC、26KDa和ureA基因）的引物和21對毒力相關基因在同一反應體系中均得到有效表達。探索到最佳反應條件為:94℃預變性1min，94℃變性30s，60℃退火30s，70℃延伸1min，35個循環(huán)，最后70℃延伸1min。引物最適濃度:ur

6、eC基因的正向引物為200nmol/μL，反向引物為1μmol/μL;其余每對引物的濃度均為200nmol/μL。最佳模板濃度為10nmol～20nmol范圍之間。
　　2.多重基因分析系統(tǒng)靈敏度和特異度的評估
　　對各梯度的擴增結果顯示，該系統(tǒng)最少可以擴增出10拷貝的ureC基因，靈敏度很高;用大腸埃希菌標準菌株ATCC25922、銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853、乙肝病毒標準質(zhì)控品、水作為陰性模版作為陰性對照體系時

7、，該多重基因分析系統(tǒng)并沒有出現(xiàn)任何擴增信號，表明系統(tǒng)高度特異。
　　3.通過建立H.pylori標準定量曲線建立定量分析系統(tǒng)
　　選取1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10梯度建立標準曲線。8個點對應的GeXP的曲線下面積分別為105032、62315、56476、47014、33849、23843、11106、7023。根據(jù)各梯度拷貝數(shù)和其所對應的GeXP曲線下面積來建立標

8、準定量曲線。所得標準曲線的相關系數(shù)r=0.99817222＞0.99，因此該標準定量曲線可以用來對H.pylori進行定量。
　　結論：
　　1.多重基因分析系統(tǒng)應用于H.pylori的檢測能同時檢測多個基因位點的表達，可以利用多基因來確證H.pylori的感染，同時根據(jù)多重毒力相關基因的表達情況可以預測H.pylori的致病性，具有重要臨床指導意義。
　　2.該多重基因分析系統(tǒng)具有快速、高靈敏度和高特異度的特點，還可