多重PCR檢測(cè)禽致病性大腸桿菌毒力基因方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、隨著養(yǎng)禽業(yè)迅速發(fā)展，各類細(xì)菌性疾病日益嚴(yán)重，特別是大腸桿菌病一直是限制養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的最主要的疾病之一。為建立一種特異性的禽大腸桿菌病檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GeneBank收錄的APEC毒力基因papC、iucD、tsh、irp2、iss序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)并合成5對(duì)特異性引物，建立一種同時(shí)檢測(cè)APEC 5種毒力基因的多重PCR方法，并應(yīng)用此方法檢測(cè)APEC安徽分離株的毒力基因。結(jié)果如下： 1．APECdOpapC、iucD、irp2、

2、tsh、iss單基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)APEC的致病機(jī)理，從細(xì)菌的粘附定居、參與鐵攝取和增強(qiáng)血清抗性等方面考慮，參照GeneBank收錄的禽致病性大腸桿菌P型菌毛基因papC、產(chǎn)氣桿菌素基因iucD、溫度敏感性血凝素基因tsh、鐵抑制蛋白基因irp2、血清抗性蛋白基因iss的序列，設(shè)計(jì)并合成5對(duì)特異性引物。以E．coli O<,1>(CVCC249)、O<,2>(CVCC1565)、O<,78>(CVCC1555)標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA

3、為模板，將5種基因分別進(jìn)行單基因PCR擴(kuò)增，以篩選多重PCR的陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl<,2>(25mM)3.0μL，dNTP(10mM)1.0μL，引物各0.5μL(10pmol)，Taq DNA聚合酶(5U·μL<'-10>)0.4gL，DNA模板2.0μL，加滅菌超純水至25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，68℃延伸3mi

4、n，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。結(jié)果3種血清型的菌株中5種基因的檢出率均為100％，因此均可用做陽(yáng)性對(duì)照的模板。選擇其中一種血清型菌株E．coliO<,2>(CVCC1565)，對(duì)從中擴(kuò)增出的5種基因進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，并提呈NCBI BLAST 2 SEQUENCES，與GeneBank中公布的進(jìn)行基因同源性分析。結(jié)果顯示所得的片段與預(yù)計(jì)的基本一致，且同源性在98％～99％。 2．APEC中papC、iucD、

5、irp2、tsh、iss多重PCR方法的建立 根據(jù)單基因PCR擴(kuò)增條件，通過(guò)逐步優(yōu)化引物組合濃度、鎂離子濃度、TaqDNA聚合酶量、退火溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)和DNA模板提取方法等條件，建立了同時(shí)檢測(cè)5種毒力基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2.5μL 10×PCR緩沖液，2.5μLMgCl<,2>(25mM)，1.0μLdNTP(10mM)，0.5μL引物(10pmol)，0.5μLTaq DN

6、A聚合酶(5U·μL<'-1>)，2.0μL LDNA模板，加滅菌超純水至25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，68℃延伸3min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。菌液最低檢出濃度為10<'2>cfu·mL<'-1>，且具有特異性。 3．APEC安徽分離株毒力基因的多重PCR檢測(cè) 應(yīng)用所建立的多重PCR方法檢測(cè)了9株APEC安徽分離株，以驗(yàn)證所建立的多重PCR方

7、法的實(shí)用性，并確定了9株APEC安徽分離株的毒力基因型。分別提取各分離株的基因組DNA作為模板，進(jìn)行papC、tsh、iucD、irp2和iss基因的多重PCR擴(kuò)增。結(jié)果1株鴨源和3株雞源的APEC中均擴(kuò)增出4條毒力基因條帶，1株鵝源和4株雞源的APEC中均擴(kuò)增出5條毒力基因條帶。在9株APEC安徽分離株中iss、irp2、papC和iucD基因的攜帶率均為100％，tsh基因的攜帶率為55.6％。9株APEC安徽分離株分布于兩個(gè)毒力基

8、因型，其中5株為iss<'+>irp2<'+>papC<'+>iucD<'+>tsh<'+>，占55.6％；4株為iss<'+>irp2<'+>papC<'+>iucD<'+>tsh<'->，占44.4％。表明iss、irp2、papC和iucD基因廣泛存在于APEC中。 以上研究表明，本文建立的多重PCR方法可從APEC分離菌株中檢測(cè)出任何一種或任何組合的毒力基因，其特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好，敏感度可以達(dá)到10<'2>cfu·mL<