分離X、Y精子純度評價方法的研究.pdf

1、動物性別直接影響到畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。因此，控制出生動物性別是人們長期以來研究解決的焦點和難點。性別控制是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預(yù)，使雌性動物生產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)。通過性別控制，不但可減少人類性連鎖遺傳疾病的發(fā)生，可挽救瀕臨滅絕的珍稀物種，而且可選擇不同性別的家畜，滿足畜牧生產(chǎn)需要。 為實現(xiàn)從源頭上進行高水平性別控制，精子分離成為研究的焦點，而對于精子分離，無論是方法的建立，還是方法的優(yōu)化都離不開高效

2、、快速的評價體系作為技術(shù)保障，兩者相伴而生、相互依賴，所以評價方法是否完善也是學(xué)界倍加關(guān)注的焦點。 流式細胞儀分離X、Y精子這項技術(shù)標志著X、Y精子分離技術(shù)取得很大進步，國際上已有很多公司利用這一技術(shù)進行X、Y精子分離與推廣，與此同時其評價技術(shù)體系也在研究探索之中并取得了很大進步，如：流式細胞儀重分析法，單精子巢式PCR評價法。雖然還有很多技術(shù)細節(jié)有待于進行深入探究，但隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展及科研人員的不斷努力，在提高評價方法

3、可信性的前提下，其評價手段也將會取得新的進步，尤其是通過對單精子巢式PCR評價法各個技術(shù)參數(shù)的認真研究，很可能取得很大的突破，減少勞動強度、縮短評價過程所需時間，使本方法逐漸成熟，并最終擺脫對大型專有儀器的依賴，而成為一種常規(guī)化、低成本化的檢測手段，并促進性控精液在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。同時簡便、快捷評價方法的建立與優(yōu)化也必會促進人類及其他X、Y染色體差異少的物種精子分離研究的突破。 本研究進行以下實驗研究： （1）首先采用

4、流式細胞儀進行牛X、Y精子分離，然后將分離的X、Y精子分成三部分，并以其中一部分分離精液和常規(guī)精液為實驗材料建立了單精子PCR評價法，并分別采用熒光原位雜交方法和流式細胞重分析法通過對分離精液和常規(guī)精液進行X、Y精子比例分析對PCR方法進行了驗證和分析。 （2）單精子PCR鑒定分離X、Y精子純度：本部分實驗根據(jù)Y染色體上，Sry基因設(shè)計一對引物，同時為防止假陰性結(jié)果出現(xiàn)，根據(jù)牛3號常染色體序列設(shè)計一對內(nèi)標引物，采用雙重PCR建立

5、單精子性別分析技術(shù)方法，使用單精子快速PCR技術(shù)對分離的牛X、Y精子進行純度鑒定。本實驗的常規(guī)快速PCR方法不但縮短了檢測分析時間，而且避免了巢式PCR易污染的現(xiàn)象。 （3）熒光原位雜交技術(shù)鑒定分離牛X、Y精子純度：本實驗采用Y染色體上特異基因DNA序列作為探針模板制作探針，與去凝縮的精子頭進行熒光原位雜交，對精子進行了性別分析，有特異熒光信號的為Y精子，無特異信號的為X精子。結(jié)果由于本實驗設(shè)計發(fā)光部位片段僅2052bp，不能在