牛X-、Y-精子消減Cdna文庫(kù)的篩選及差異表達(dá)基因的分析.pdf

1、雄性哺乳動(dòng)物可同時(shí)產(chǎn)生X-、Y-精子,研究?jī)煞N精子的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于揭示精子發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)具有重要理論意義,同時(shí)在家畜性別控制技術(shù)研究中也具有重要的地位。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,相鄰精子的基因表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)細(xì)胞間橋被共享,檢測(cè)兩種性別精子的表達(dá)差異已沒(méi)有意義,然而目前沒(méi)有證據(jù)表明細(xì)胞間橋使所有的表達(dá)產(chǎn)物共享。為研究X-、Y-精子間基因表達(dá)差異情況,本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了牛X-、Y-消減cDNA文庫(kù)。本研究采用芯片技術(shù)與序列同源性分析相結(jié)合的方法對(duì)文庫(kù)中

2、的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析,并通過(guò)real-time RT-PCR方法驗(yàn)證了芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　 1.牛X-、Y-精子消減cDNA的篩選
　　 采用cDNA芯片技術(shù)對(duì)已構(gòu)建的牛X-、Y-精子消減cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。根據(jù)文庫(kù)的序列中信息,選取201個(gè)代表所有unigenes clones的PCR純化產(chǎn)物點(diǎn)制了cDNA芯片；分別制備X-、Y-精子總RNA,并進(jìn)行兩輪mRNA線性擴(kuò)增,將得到的aRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,

3、再對(duì)cDNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；將cDNA芯片與標(biāo)記的cDNA雜交。采用SAM軟件分析3張生物學(xué)重復(fù)芯片的數(shù)據(jù),獲得31個(gè)陽(yáng)性差異表達(dá)clones,即陽(yáng)性差異表達(dá)unigenes,其中4個(gè)在Y-精子中上調(diào),27個(gè)在X-精子中上調(diào)。
　　 2.差異表達(dá)基因的序列同源性分析
　　 對(duì)經(jīng)過(guò)芯片雜交驗(yàn)證的陽(yáng)性差異表達(dá)基因的Blastx比對(duì)結(jié)果顯示,有12.9％的unigenes(4個(gè)contigs)與SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的蛋

4、白質(zhì)高度同源(E-value≤1×10-10),其中1個(gè)基因在Y-精子中上調(diào),3個(gè)基因在X-精子中上調(diào),并且這4個(gè)基因都與精子的基礎(chǔ)生命活動(dòng)相關(guān)。對(duì)剩余差異表達(dá)基因的Blastn比對(duì)結(jié)果顯示,32.26％的unigenes(7個(gè)contigs和3個(gè)singlets)與牛EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列高度同源(E-value≤1×10-10),認(rèn)為是未知功能的基因,其中1個(gè)基因在Y-精子中上調(diào),9個(gè)基因在X-精子中上調(diào)。其余54.84％的unige

5、nes在數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到同源序列(E-value≥1×10-10),認(rèn)為可能是新基因。
　　 3.Real-time RT-PCR對(duì)兩個(gè)基因表達(dá)情況的檢測(cè)
　　 對(duì)陽(yáng)性差異表達(dá)基因細(xì)胞色素b基因(Cytochrome b,CYTB)和鐵硫簇支架蛋白基因(Iron-sulfur cluster scaffold.ISCU)在X-、Y-精子中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示兩個(gè)基因在X-精子中的表達(dá)量分別是在Y-精子中的1.731