FPV復制非必需位點的篩選及重組病毒生物學特性比較.pdf

1、雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)基因組龐大，其基因組由260～309 kb雙鏈DNA組成，含有大量的復制非必需區(qū)可以作為外源基因的插入位點，可以容納25～30 kb的外源基因。而且，F(xiàn)PV只對禽類有感染性，病毒不能在哺乳動物體內(nèi)增殖，使得FPV作為載體有很好的生物安全性。FPV作為動物病毒的表達載體表現(xiàn)出了其獨特的優(yōu)越性。
　　以FPV為載體的重組病毒活載體疫苗在近二十多年來取得了很大的進展，特別是一些如禽流感、新城

2、疫、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病及馬立克氏病等引起禽類疾病的病毒的保護性抗原基因已經(jīng)在FPV上成功表達。構(gòu)建以FPV為載體的重組病毒的過程中，首先要做的就是對病毒復制非必需區(qū)的選擇。但是，現(xiàn)在國內(nèi)在FPV重組位點的選擇上研究還比較少，而且重組位點的選擇會影響到重組病毒的復制能力及外源基因的表達水平。因此，篩選并優(yōu)化以我國的FPV疫苗株為基礎(chǔ)的復制非必需區(qū)是至關(guān)重要的，這也對以后構(gòu)建高效安全的重組FPV載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

3、
　　本研究采用定向克隆的方法篩選FPV的復制非必需區(qū)。在復制非必需區(qū)的選擇上，盡量以不影響FPV的復制、毒力及生物學特性為基礎(chǔ)。為篩選高效的FPV基因組外源基因的插入位點，本研究選擇FPV的FPV054基因內(nèi)部及FPV161與FPV162之間的基因間隔區(qū)作為重組位點，構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉(zhuǎn)移載體，以表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組FPV（rFPV-gB）為親本病毒，通過在雞胚成纖維細胞(CEF)中同

4、源重組，制各表達綠色熒光蛋白報告基因的重組雞痘病毒，經(jīng)過3輪蝕斑純化篩選獲得能夠穩(wěn)定表達EGFP的重組病毒，分別命名為rFPV054-EGFP和rFPV161-EGFP。將重組病毒與親本病毒連續(xù)傳代20代，通過對每5代病毒的PCR鑒定，檢測到外源基因在病毒的傳代過程中始終存在，且沒有發(fā)生改變;同時，對外源基因表達的免疫印記檢測也進一步證明了所表達的蛋白的抗原性;通過對每代病毒所感染的細胞的熒光觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因能穩(wěn)定持續(xù)表達。復