重組馬立克氏病毒及其突變株生物學(xué)活性的比較研究.pdf

1、馬立克氏病毒(Marek's disease virus，MDV)是α皰疹病毒的成員，基因組為180kb左右的雙股DNA，可引起雞的淋巴細胞瘤。GX0101株MDV是國內(nèi)外從雞體內(nèi)分離到的第一株整合有網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)長末端重復(fù)序列(Long terminal repeat，LTR)的重組野毒株。本實驗室前期研究中已經(jīng)構(gòu)建了GX0101的細菌人工染色體(Bacteri

2、al artificial chromosome，BAC)克隆以及敲除REV-LTR的突變株GX0101ΔLTR，證實REV-LTR插入片段顯著增強了GX0101的橫向傳播能力。敲除腫瘤基因meq的突變株GX0101Δmeq病毒不但喪失對SPF雞的致病性，而且不再引起腫瘤以及胸腺和法氏囊萎縮。本學(xué)位論文在上述研究的基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建不同的突變株，并以此深入研究MDV相關(guān)的生物學(xué)活性和研發(fā)MDV的基因缺失疫苗。
　　 1完成了GX

3、0101株MDV的全基因組序列分析
　　 自然重組病毒GX0101在致病性、免疫原性、橫向傳播能力等方面具有獨特的生物學(xué)活性。為了對GX0101進一步的分子病毒學(xué)研究，本研究利用GX0101的BAC克隆結(jié)合高通量測序技術(shù)完成了對其全基因組的序列分析。
　　 GX0101全基因組長178101bp，其基因組的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS區(qū)分別長12758bp、113572bp、12741bp、12700bp、

4、11695bp、13134bp。GX0101全基因組僅含有一個REV-LTR重組片段，位于其基因組US區(qū)的SORF1中，SORF2基因前267bp堿基處。與rMd5不同，GX0101含有一個SORF2基因。通過與已發(fā)表的近10株MDV的比較，發(fā)現(xiàn)GX0101與英國分離株C12/130的兩個不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。除了GX0101比其它毒株多出REV-LTR片段外，在經(jīng)比較的190個開

5、放閱讀框(Open reading frame，ORE)中，不同毒株間發(fā)生不同程度變異的有77個。在這77個ORFs中，GX0101與pC12/130-10、pC12/130-15兩個克隆呈100％同源的ORF分別有50個和47個，但與RB1B、Md5、GA、814和CVI988等毒株卻只有7-27個ORFs呈現(xiàn)100％同源性。GX0101基因組TRS區(qū)的MDV97.3-97.6開放閱讀框中，有5個連續(xù)的217bp堿基的重復(fù)，顯著多于其

6、它不同毒株的拷貝數(shù)。GX0101基因組的IRS區(qū)的86.2-86.4開放閱讀框中，存在3個相同的217bp的重復(fù)序列，而其它MDV僅含有1-2拷貝的重復(fù)。
　　 GX0101的全基因組序列的比較分析，將有助于闡明與MDV致病性、傳播性相關(guān)的基因，也有助于揭示不同地域間MDV的遺傳變異和演化關(guān)系。
　　 2構(gòu)建了meq基因缺失性疫苗候選株SC9-1，在SPF雞實驗中顯示出比國內(nèi)外最廣泛應(yīng)用的CVI988/Rispens有更

7、好的保護性免疫力
　　 重組病毒GX0101Δmeq表現(xiàn)出良好的保護性免疫作用，但基因組中帶有卡納霉素抗性基因，不符合農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全條例，因此不能作為疫苗使用。
　　 本研究設(shè)計的“對flp重組酶的部分誘導(dǎo)結(jié)合多重篩選”的方法，敲除掉GX0101Δmeq中的卡那霉素抗性基因，篩選到具有良好復(fù)制能力的SC9-1(GX0101ΔmeqΔkana)株MDV。將SC9-1株MDV接種SPF雞和含有MDV母源抗體的海蘭褐蛋雞，

8、既沒有致腫瘤性，也沒有呈現(xiàn)免疫抑制、生長遲緩等任何致病性，而且能夠為免疫雞提供比CVI988/Rispens更好的保護性免疫。多次重復(fù)SC9-1株MDV對SPF雞的免疫保護試驗，以500PFU/只的劑量感染MDV超強毒rMd5，SC9-1均提供100％的免疫保護，顯著高于CVI988/Rispens的免疫保護(保護率80-90％)。將SC9-1感染性克隆DNA通過肌肉注射1日齡SPF雞，14天后能從雞的體內(nèi)分離到SC9-1病毒。為進一步

9、探討SC9-1的BAC質(zhì)粒作為DNA疫苗提供思路。
　　 SC9-1株MDV基因缺失疫苗已獲得農(nóng)業(yè)部環(huán)境釋放的審批書，并在3000只海蘭褐蛋雞完成了6個月的環(huán)境釋放試驗，并且持續(xù)觀察6個月，不僅符合農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全，而且呈現(xiàn)很好的免疫保護效果，是一株理想的新型疫苗株，并且已經(jīng)轉(zhuǎn)讓給北京翎羽生物科技有限公司進行后續(xù)相關(guān)的生產(chǎn)性試驗。制備的中試產(chǎn)品證明SC9-1能提供比國內(nèi)外最廣泛應(yīng)用的CVI988/Rispens株疫苗更好的保護

10、性免疫力
　　 3對GX0101和GX0101ΔLTR混合感染雞群后連續(xù)病毒鑒別定量跟蹤試驗證明，REV-LTR插入片段使GX0101提高橫向傳播性，是其成為流行毒株的競爭性選擇壓優(yōu)勢
　　 為了模擬自然感染傳播模式，比較并證實GX0101相對于其突變株GX0101ΔLTR在雞群橫向傳播上的競爭性選擇壓優(yōu)勢，本研究比較研究了能夠?qū)X0101和GX0101ΔLTR病毒基因組作鑒別性定量的雙重?zé)晒舛縋CR的引物、探針和反

11、應(yīng)體系，并且成功的用于動態(tài)比較雞群共感染以上兩種病毒后在連續(xù)傳代過程中不同病毒病毒血癥。
　　 結(jié)果表明，將GX0101、GX0101ΔLTR同等劑量感染SPF雞后，第一代用于接觸感染的空白SPF雞在接觸感染14天時即可檢測到感染GX0101，而在接觸感染28天時才能檢測到感染GX0101ΔLTR;而第二代用于接觸感染的雞在接觸感染21、28天均能檢測到感染GX0101，在28天時僅有一只雞檢測到GX0101ΔLTR;同樣第三代

12、用于接觸感染的雞在與第二代雞接觸感染21、28天均能檢測到感染GXO101，而沒有檢測到GX0101ΔLTR。將GX0101顯著低于GX0101ΔLTR(100PFU/只的GX0101和2000PFU/只的GX0101ΔLTR)的病毒共感染SPF雞群，同一個隔離罩飼養(yǎng)進行接觸感染傳播。連續(xù)2次傳代后，雖然在一部分接觸感染病毒的雞(6/10)中仍能夠檢出GX0101ΔLTR，甚至在個別雞仍為優(yōu)勢毒株，但是接觸感染病毒的雞全部能夠檢出帶有R

13、EV-LTR的GX0101，并且部分雞(4/10)僅能檢出GX0101，不能檢出GX0101ΔLTR。
　　 以上結(jié)果證明了在雞群內(nèi)自然感染和傳播過程中，帶有REV-LTR的GX0101相對于敲除其REV-LTR的GX0101ΔLTR株在橫向傳播性上顯示出明顯的競爭性選擇壓優(yōu)勢。這可以解釋為什么在雞群中發(fā)生率很低的MDV與REV間的基因重組產(chǎn)生的整合有REV-LTR的GX0101能從極低的比例演變?yōu)閺碾u群中易于分離到的流行株的生

14、物學(xué)機制。
　　 4敲除GX0101株SORF2基因的生物學(xué)活性比較表明SORF2基因表達產(chǎn)物與MDV不同株的橫向傳播性密切相關(guān)
　　 REV-LTR片段具有真核啟動子和增強子活性，能夠增強位于其插入位點后的MDV基因的表達。GX0101基因組中的REV-LTR片段位于SORF2基因上游，其對SORF2基因的轉(zhuǎn)錄表達都可能有很大影響，為了深入研究重組病毒GX0101的SORF2基因功能，本研究在感染性克隆GX0101-B

15、AC的基礎(chǔ)上構(gòu)建了SORF2基因缺失株GX0101Δsorf2。
　　 試驗結(jié)果表明SORF2基因并非MDV復(fù)制以及致腫瘤必需基因，敲除掉SORF2基因的GX0101Δsorf2在細胞培養(yǎng)與GX0101的復(fù)制能力相同。與GX0101相比，GX0101Δsorf2對雞的致死率以及致腫瘤率下降，但是差異不顯著。GX0101Δsorf2橫向傳播的感染率低于GX0101。GX0101中的REV-LTR片段插入增強SORF2蛋白的表達，表

16、明GX0101具有較強的橫向傳播能力可能與SORF2蛋白的大量表達這一分子機制相關(guān)。
　　 5插入ALV-LTR的重組MDV的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的比較研究
　　 ALV與REV一樣同屬于禽反轉(zhuǎn)錄病毒，在我國雞群中普遍存在MDV與ALV的共感染。為了研究ALV-LTR片段在GX0101基因組重組位點上的穩(wěn)定性，以及ALV-LTR片段的插入對MDV生物學(xué)活性的影響，并以此為模型研究ALV與MDV的重組病毒。本研究利用基于鏈霉

17、素負篩選系統(tǒng)的同源重組方法將ALV-J中國分離株NX0101的LTR片段完全等位取代bac-GX0101的REV-LTR片段，構(gòu)建了含有ALV-LTR片段的重組病毒GX0101-ALV-LTR。
　　 GX0101-ALV-LTR在細胞培養(yǎng)上具有與GX0101相似的復(fù)制能力，在細胞上連續(xù)傳代20代，通過PCR驗證，ALV-LTR都能在GX0101-ALV-LTR的基因組中穩(wěn)定存在。將GX0101-ALV-LTR接種1日齡SPF雞

18、，接種后6-8周，PCR驗證ALV-LTR能在GX0101-ALV-LTR基因組中穩(wěn)定存在。通過接觸感染的病毒基因組中ALV-LTR依然能夠穩(wěn)定遺傳。攻毒90天，GX0101-ALV-LTR的死亡率和腫瘤率分別為55％和20％。相比GX0101ΔLTR，間接免疫熒光以及Westem Blot試驗顯示，GX0101-ALV-LTR的SORF2蛋白表達量顯著增加;Northern Blot試驗顯示GX0101-ALV-LTR的SORF2、U

19、S1、US10基因轉(zhuǎn)錄量顯著增加。
　　 GX0101-ALV-LTR是國內(nèi)外第一株整合進ALV來源LTR的重組MDV,證實整合進MDV同一位點的ALV-LTR片段能與插入的REV-LTR片段一樣穩(wěn)定遺傳，并顯示類似的生物學(xué)特性。
　　 6用基因芯片技術(shù)比較分析了LTR插入片段對重組MDV中不同基因表達水平的影響利用定制的Agilent表達譜芯片，分析比較了帶有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101ΔL

20、TR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR在感染CEF細胞上的病毒不同基因的表達水平。結(jié)果表明，在GX0101與GX0101ΔLTR病毒差異表達顯著的基因中(P＜0.05)，75個MDV基因GX0101的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，其中上調(diào)倍數(shù)大于10倍的共14個基因，而位于REV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上調(diào)倍數(shù)多達30倍以上，其中SORF2基因上調(diào)最為顯著，高達399倍;GX0101的UL38基因轉(zhuǎn)錄降

21、低，下調(diào)倍數(shù)為8.3倍。GX0101-ALV-LTR與GX0101非常類似，與GX0101ΔLTR相比，同樣位于ALV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上調(diào)倍數(shù)多達30倍以上，SORF2基因上調(diào)最為顯著;GX0101-ALV-LTR的UL38基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)倍數(shù)為6.7倍。利用Northern Blot以及Western Blot試驗證實了插入LTR片段的重組病毒SORF2的轉(zhuǎn)錄子及表達蛋白均顯著升高。
　　 這

22、些比較研究結(jié)果將有助于進一步分析LTR插入片段賦予重組MDV顯著升高的橫向傳播性究竟與MDV的那些基因表達產(chǎn)物相關(guān)。
　　 7用基因芯片技術(shù)比較分析了LTR插入片段對重組MDV感染的細胞基因組不同基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 利用定制的Agilent表達譜芯片，分析比較了帶有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101ΔLTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR對感染的CEF細胞基因組不同基因的表達

23、水平的影響。
　　 對雞41765個基因的表達差異進行了分析，結(jié)果顯示，感染GX0101的CEF細胞基因與感染GX0101ΔLTR相比，轉(zhuǎn)錄顯著增高的有12個基因（差異倍數(shù)大于20倍），其中ChEST1024a11(GeneBank NO.BU288902.1)、SKOR2(GeneBank NO.XM001233569.2)上調(diào)倍數(shù)分別為190倍、165倍;轉(zhuǎn)錄顯著降低的基因有4個基因（差異倍數(shù)大于20倍），其中 ChEST4

24、45i1(GeneBank NO.CR390488.1)下調(diào)倍數(shù)為105倍。感染GX0101-ALV-LTR的CEF細胞基因與感染GX0101ΔLTR相比，轉(zhuǎn)錄顯著增高的有5個基因（差異倍數(shù)大于20倍），其中ChEST1024a11(GeneBank NO.BU288902.1)、SKOR2(GeneBank NO.XM001233569.2)上調(diào)倍數(shù)分別為203倍、83倍;轉(zhuǎn)錄水平下降基因的下調(diào)倍數(shù)均小于20倍。
　　 通過基

25、因芯片表達譜篩選出的顯著差異基因有助于進一步研究插入LTR片段的重組MDV病毒不同的生物學(xué)活性與宿主基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性。
　　 本研究不僅進一步通過模擬自然感染模式證明REV-LTR插入片段顯著提高了病毒GX0101在雞群中的橫向傳播性，是其從極少數(shù)的突變株變?yōu)榱餍兄甑牧餍胁W(xué)機制，也部分闡明了REV-LTR提高GX0101橫向傳播性的分子機制。還利用BAC克隆技術(shù)將GX0101改造成了一株保護免疫力優(yōu)于CVI988/Risp