巨型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及篩選.pdf

1、巨型艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria maxima)隸屬于頂復(fù)器門(mén)(Apicomplexa)、孢子蟲(chóng)綱(Sporozoasida)、真球蟲(chóng)目(Eucoccidiorida)、艾美耳科(Eimeriidae)、艾美耳屬(Eimeria)，是9種雞球蟲(chóng)之一，也是集約化養(yǎng)雞場(chǎng)最常見(jiàn)且對(duì)雞危害較大的蟲(chóng)種之一，呈世界性分布，我國(guó)已有25個(gè)省(市、區(qū))報(bào)道存在。巨型艾美耳球蟲(chóng)免疫原性強(qiáng)，是組成雞球蟲(chóng)疫苗的重要種類(lèi)。國(guó)內(nèi)外已建立了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E. te

2、nella)、堆形艾美耳球蟲(chóng)(E. acervulina)不同發(fā)育階段的cDNA文庫(kù)，從文庫(kù)中篩選了多種重要抗原基因，為研究球蟲(chóng)的分子疫苗和探索基因功能奠定了基礎(chǔ)。本文采用實(shí)驗(yàn)室單卵囊分離并經(jīng)鑒定為巨型艾美耳球蟲(chóng)的孢子化卵囊構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫(kù)，采用2種方法進(jìn)行文庫(kù)篩選，為尋找抗原基因和研制基因疫苗提供條件。 首先，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的單卵囊分離物進(jìn)行種類(lèi)鑒定。用單卵囊分離物感染2周齡雛雞，經(jīng)檢測(cè)其潛伏期為144 h，主要寄生于小腸中

3、段；收集卵囊培養(yǎng)，其最短孢子化時(shí)間為23h ；觀測(cè)100個(gè)孢子化卵囊，呈卵圓形，有極粒，無(wú)卵囊殘?bào)w，未見(jiàn)卵膜孔和極帽，其長(zhǎng)寬范圍為21.25～37.25μm×16.50～28.00μm，形狀指數(shù)1.28；檢測(cè)100個(gè)孢子囊，有斯氏體，無(wú)孢子囊殘?bào)w，長(zhǎng)寬范圍為15.00～17.50μm×7.50～10.50μm。對(duì)照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，鑒定為巨型艾美耳球蟲(chóng)(編號(hào)為CAAS 2111130303)。 其次，構(gòu)建巨型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDN

4、A文庫(kù)。將巨型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊經(jīng)漂浮法去除雜質(zhì)，提取總RNA，其OD260/OD280值為1.9；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，樣品的28 S和18 S條帶清晰：以總RNA為模板、λTriple×2(TM)為載體，利用SMART(TM)cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，其原始文庫(kù)容量為1×106 pfu/mL，擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為5×1010 pfu/mL，重組率為95％，插入片斷主要集中在0.5～1 Kb之間；根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，從

5、文庫(kù)中擴(kuò)增出編碼巨型艾美耳球蟲(chóng)免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白的基因序列片段，表明所建文庫(kù)質(zhì)量好。 第三，巨型艾美耳球蟲(chóng)cDNA文庫(kù)篩選。對(duì)所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行了2種途徑篩選獲得EST序列。1)免疫篩選，用孢子化卵囊可溶性蛋白免疫兔子，獲得抗血清，以抗體為探針，對(duì)整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得一段EST序列，經(jīng)BLASTn比對(duì)確認(rèn)為巨型艾美耳球蟲(chóng)核糖體小亞基RNA基因序列；2)直接將λTriplEx2噬菌體文庫(kù)轉(zhuǎn)化為pTriplEx2文庫(kù)，獲