巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫的構(gòu)建及篩選.pdf

1、巨型艾美耳球蟲(Eimeria maxima)隸屬于頂復器門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoasida)、真球蟲目(Eucoccidiorida)、艾美耳科(Eimeriidae)、艾美耳屬(Eimeria)，是9種雞球蟲之一，也是集約化養(yǎng)雞場最常見且對雞危害較大的蟲種之一，呈世界性分布，我國已有25個省(市、區(qū))報道存在。巨型艾美耳球蟲免疫原性強，是組成雞球蟲疫苗的重要種類。國內(nèi)外已建立了柔嫩艾美耳球蟲(E. te

2、nella)、堆形艾美耳球蟲(E. acervulina)不同發(fā)育階段的cDNA文庫，從文庫中篩選了多種重要抗原基因，為研究球蟲的分子疫苗和探索基因功能奠定了基礎(chǔ)。本文采用實驗室單卵囊分離并經(jīng)鑒定為巨型艾美耳球蟲的孢子化卵囊構(gòu)建cDNA表達文庫，采用2種方法進行文庫篩選，為尋找抗原基因和研制基因疫苗提供條件。 首先，對實驗室保存的單卵囊分離物進行種類鑒定。用單卵囊分離物感染2周齡雛雞，經(jīng)檢測其潛伏期為144 h，主要寄生于小腸中

3、段；收集卵囊培養(yǎng)，其最短孢子化時間為23h ；觀測100個孢子化卵囊，呈卵圓形，有極粒，無卵囊殘體，未見卵膜孔和極帽，其長寬范圍為21.25～37.25μm×16.50～28.00μm，形狀指數(shù)1.28；檢測100個孢子囊，有斯氏體，無孢子囊殘體，長寬范圍為15.00～17.50μm×7.50～10.50μm。對照國內(nèi)外文獻，鑒定為巨型艾美耳球蟲(編號為CAAS 2111130303)。 其次，構(gòu)建巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊cDN

4、A文庫。將巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊經(jīng)漂浮法去除雜質(zhì)，提取總RNA，其OD260/OD280值為1.9；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，樣品的28 S和18 S條帶清晰：以總RNA為模板、λTriple×2(TM)為載體，利用SMART(TM)cDNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建全長cDNA文庫，其原始文庫容量為1×106 pfu/mL，擴增后的文庫滴度為5×1010 pfu/mL，重組率為95％，插入片斷主要集中在0.5～1 Kb之間；根據(jù)已知序列設(shè)計引物，從

5、文庫中擴增出編碼巨型艾美耳球蟲免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白的基因序列片段，表明所建文庫質(zhì)量好。 第三，巨型艾美耳球蟲cDNA文庫篩選。對所構(gòu)建的cDNA文庫進行了2種途徑篩選獲得EST序列。1)免疫篩選，用孢子化卵囊可溶性蛋白免疫兔子，獲得抗血清，以抗體為探針，對整個文庫進行篩選，獲得一段EST序列，經(jīng)BLASTn比對確認為巨型艾美耳球蟲核糖體小亞基RNA基因序列；2)直接將λTriplEx2噬菌體文庫轉(zhuǎn)化為pTriplEx2文庫，獲