堆形艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)構(gòu)建與抗原基因篩選.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞腸道所引起的一種危害嚴(yán)重的全球性寄生蟲(chóng)病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制球蟲(chóng)病的主要方法包括化學(xué)藥物防治和疫苗免疫預(yù)防，但由于這些方法存在安全、價(jià)格以及抗藥蟲(chóng)株出現(xiàn)等問(wèn)題，迫切需要尋找新的防治手段來(lái)控制球蟲(chóng)病。研制高效安全抗球蟲(chóng)病基因工程疫苗的關(guān)鍵在于尋找到重要的蟲(chóng)體抗原基因。 本研究首先利用傳統(tǒng)生物學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所選的堆形艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria acervulina)蟲(chóng)株進(jìn)行了鑒定，包括潛

2、在期、寄生部位、最短孢子化時(shí)間、卵囊形狀、卵囊大小及孢子囊大小等。利用SMARTTM eDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了堆形艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊eDNA文庫(kù)，文庫(kù)庫(kù)容量為4.7×106pfw/mL，重組率為98％；擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為4.4×1010pfu/mL插入片段平均大小約為1000 bp。用堆形艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊可溶性抗原免疫兔血清篩選構(gòu)建的eDNA文庫(kù)，獲得6個(gè)陽(yáng)性克隆，PCR鑒定1～3號(hào)陽(yáng)性克隆的插入片段大小約為1000bp，

3、4～6號(hào)克隆約為1500 bp。隨機(jī)選取1個(gè)陽(yáng)性克隆(dui10)進(jìn)行測(cè)序，將所得序列與GenBank進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)dui10為-新基因(GenBank登錄號(hào)：EU590120)，該基因有1個(gè)完整開(kāi)放閱讀框，編碼163個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析顯示該新基因含有1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)。另外，利用PCR方法從構(gòu)建的堆形艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊eDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出了巨噬

4、細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因(macrophage migration inhibitory factor，MIF)，將該基因連接到原核表達(dá)載體pET28a(+)，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-MIF，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳親和層析柱純化重組蛋白pET28a-MIF，Western-blot分析，結(jié)果表明重組蛋白pET28a-MIF具有良好的抗原性。 本研究成功構(gòu)建了堆形艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊eDNA文庫(kù)，