神經病理性疼痛大鼠脊髓神經型一氧化氮合酶多樣性的鑒定與分析.pdf

1、背景:神經病理性疼痛是神經系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能異常所導致的痛覺異?；蛲从X過敏。創(chuàng)傷、缺血性損傷、感染或炎癥、腫瘤、藥物和壓迫等原因均可以引起神經病理性疼痛。非甾體類抗炎藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥治療神經病理性疼痛的效果差，臨床上常使用三環(huán)類抗抑郁藥和抗癲癇藥物進行治療，但療效差，副作用大，能夠有效緩解50％以上疼痛癥狀的患者不足50％。 神經病理性疼痛的機制尚不清楚，現(xiàn)在的研究多集中在外周初級感覺神經元和脊髓痛覺傳遞神經元的變化上，所以從

2、解剖上被分為外周和中樞致痛機制；也有作者根據(jù)神經系統(tǒng)變化的可逆性與否將神經病理性疼痛的機制分為激活階段、調節(jié)階段和和修改階段。 神經病理性疼痛機制復雜，在研究中有相互矛盾的結果，一方面研究表明，神經病理性疼痛過程中，痛覺傳入神經元末梢在脊髓中釋放大量谷氨酸，谷氨酸通過激活NMDA受體提高痛覺傳遞神經元的興奮性，并且NMDA受體鄰近的NOS被NMDA受體內流的Ca2+所激活，NOS合成的NO可透過細胞膜彌散至突觸前膜加速谷氨酸釋放

3、，促進疼痛產生；另一方面也有研究表明，NOS及其合成的NO介導了嗎啡、可樂定等藥物的鎮(zhèn)痛作用，抑制NOS的活性可以減弱它們的鎮(zhèn)痛作用。 為了探討產生這種結果相互矛盾的原因，本研究選擇適當?shù)纳窠洸±硇蕴弁磩游锬Ｐ?，根?jù)脊髓中nNOS、iNOS和eNOS三種一氧化氮合酶的表達及活性變化，選擇一種具有重要調節(jié)作用的一氧化氮合酶，闡明NOS在神經病理性疼痛中的多樣性與復雜性。 方法:1.比較慢性坐骨神經縮窄損傷(CCI)、脊神經

4、結扎(SNL)、保留性神經損傷(SNI)三種神經病理性疼痛模型產生疼痛的效果，分析三種大鼠神經病理性疼痛模型脊髓水平致痛機制，選擇一種適合本研究需要的動物模型。150g～200g的SD大鼠19只，隨機分為四組(對照組、CCI組、SNL組、SNI組)，對照組(n=4)切開左后肢皮膚和肌肉，暴露坐骨神經后立即縫合，作為參照。CCI組(n=4)、SNL組(n=4)和SNI組(n=7)分別于左后肢制作CCI、SNL、SNI疼痛模型。術前3d至術

5、后11d隔日使用機械和熱輻射刺激測定術側后趾，比較它們對疼痛刺激的反應差異。術后15d測痛后，使用4％多聚甲醛灌注大鼠，取L5,6脊髓，進行免疫組化實驗；采用抗原癌基因蛋白c-Fos、星形膠質細胞標記蛋白(GFAP)和小膠質細胞標記蛋白(OX-42)抗體分別檢測神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的激活狀況。 2.檢測神經病理性疼痛大鼠脊髓中MEK-ERK與NF-kappaB信號途徑的變化，探討增加一氧化氮合酶表達的信號途徑。雌性S

6、D大鼠12只，體重150～200g，隨機分為2組(n=1O)，對照組和SNI組。對照組實施假手術，SNI組于左肢制備坐骨神經保留性神經損傷模型(SNI)。分別于術前3d、術后即刻、術后1、3、5、7、9、11d測定大鼠對機械刺激產生縮腿反應的次數(shù)。術后11d痛覺測定后，每組取3只大鼠用于灌注，應用免疫組織化學方法檢測脊髓MEK、p-MEK、p-ERK、NF-kappaB的表達；余下3只大鼠斷頭處死后分離L4-6脊髓，提取大鼠脊髓的蛋白質

7、，應用WesternBlot方法檢測p-MEK、p-ERK、NF-kappaB表達。 3.比較神經病理性疼痛大鼠模型脊髓中神經型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內皮型(eNOS)三種一氧化氮合酶的表達及活性變化，評價它們在疼痛中的調節(jié)作用。雌性SD大鼠(150～200g)20只，隨機分為2組，每組10只，分別為對照組和SNI組。對照組大鼠暴露坐骨神經后立即縫合手術切口，SNI組大鼠于左后肢制備坐骨神經保留性損傷(SNI)模型。

8、術后測定疼痛的變化，確定疼痛模型成功后，于術后第14日斷頭處死大鼠，截取L4～6段脊髓，分離左右側脊髓，于-80℃儲存對照組手術側、SNI組手術側和非手術側脊髓備用。對照組和SNI疼痛模型組各取5只大鼠脊髓，使用RT-PCR技術擴增nNOS、eNOS和iNOS片段，以β-actin作為內參照，比較SNI組與對照組NOS表達的相對差異。每組余下5只大鼠脊髓于冰上迅速勻漿，分別檢測組成型和誘導型NOS的活性。 4.分析神經病理性疼痛

9、大鼠脊髓中NR2B、nNOS和PSD95受體的表達變化，了解神經病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS和NMDA受體在功能上的協(xié)調性是否具有結構基礎。雌性SD大鼠12只，體重150～200g，隨機分為兩組(n=6)，分別為對照組和SNI組。SNI組于左肢制備坐骨神經保留性神經損傷模型(SNI)，對照組為假手術組。分別于術前3d、術后即刻、術后1、3、5、7、9、11d測定大鼠對機械刺激產生縮腿反應的次數(shù)。術后11d，每組取3只大鼠用于灌注，應用免

10、疫組織化學方法檢測脊髓NR2B和nNOS的表達；每組余下3只大鼠斷頭處死后分離L4-6段脊髓，提取組織RNA，采用RT-PCR方法檢測PSD95的轉錄水平。 5.研究神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經型一氧化氮合酶的多樣性，比較不同nNOS表達的變化。雌性SD大鼠20只，體重150～200g，隨機分為2組(n=10)，對照組和SNI組。對照組實施假手術，SNI組于左肢制備坐骨神經保留性神經損傷模型(SNI)。術前3d、術后即刻、術后

11、1、3、5、7、9、11d測定大鼠對機械刺激產生縮腿反應的次數(shù)。術后11d痛覺測定后，每組取3只大鼠用于灌注，應用免疫組織化學方法檢測脊髓nNOS的表達。每組余下7只大鼠斷頭處死后分離L4-6脊髓：提取其中3只大鼠脊髓的蛋白質，應用抗nNOS羧基端抗體和WesternBlot方法檢測nNOS的表達；提取其中4只大鼠脊髓的RNA，1只大鼠脊髓RNA進行RACE-PCR和SouthernBlot實驗檢測nNOS不同的mRNA，余下3只大鼠脊

12、髓的RNA用于檢測不同nNOS的mRNA變化。 6.比較轉染nNOSα或nNOSβ的PC12細胞NF-kappaB轉錄活性和細胞周期的改變，探討nNOSα或nNOSβ在功能上的差異性。將攜帶nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表達質粒轉化感受態(tài)細胞(由H5α細菌制作)，在H5α細菌中擴增后，提純質粒酶切鑒定。將攜帶nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表達質粒通過脂質體轉染PC12細胞，G418篩選，使用抗nNOS

13、羧基端的抗體，通過免疫組織化學和westernblot方法檢測nNOS的表達效率。提取經篩選PC12細胞的核蛋白，采用EMSA凝膠電泳阻滯實驗檢測細胞核NF-kappaB轉錄活性。經篩選PC12細胞經PI染色后流式細胞儀分選，測定凋亡細胞的百分數(shù)。 結論:研究表明組成型和誘導型一氧化氮合酶合成一氧化氮的能力具有差別，產生不同濃度的一氧化氮，對組織或細胞發(fā)揮不同的作用；本研究顯示細胞膜上的nNOSα和細胞漿里的nNOSβ截然相反地

14、調節(jié)NF-kappaB的轉錄活性；由此可以推斷：一氧化氮不僅從不同濃度，而且在細胞不同部位對細胞的生理功能或病理改變有不同的影響。 研究表明神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經元NF-kappaB活性增加，COX-2和nNOS表達升高，導致中樞敏化；本研究顯示神經病理性疼痛大鼠脊髓中增強NF-kappaB活性的nNOSα表達升高，而降低NF-kappaB活性的nNOSβ表達減弱；因此可以認為神經病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOSα和nNO