重組人神經(jīng)型一氧化氮合酶催化阿霉素單電子還原的研究.pdf

1、　　人神經(jīng)型一氧化氮合酶(hnNOS)可以催化電子從供體NADPH傳遞給醌類抗腫瘤藥物阿霉素(Adr)。活化后的Adr因引起嚴(yán)重的心血管毒性而限制其臨床藥用。我們對hnNOS催化的阿霉素單電子還原作用機制進行了研究。
　　我們成功構(gòu)建了hnNOS全長酶在大腸桿菌中的表達系統(tǒng),層析法純化得到大量高純度的酶,對其進行了性質(zhì)鑒定。發(fā)現(xiàn)用于表達細(xì)胞色素P450還原酶的原核表達系同樣適用于hnNOS；hnNOS與鼠nNOS的性質(zhì)相似。然后,

2、進一步用全長酶,和它的還原酶結(jié)構(gòu)域(FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域,FAD/FMN結(jié)合結(jié)構(gòu)域),在有氧條件下對Adr進行了催化反應(yīng),觀察和研究了反應(yīng)過程中的吸光度的改變。實驗數(shù)據(jù)顯示,hnNOS可以催化有氧狀態(tài)下,Adr對NADPH的氧化作用；鈣離子/鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)結(jié)合可以促進Adr對NADPH的氧化作用；無論有無Ca2+/CaM,黃素半醌均為反應(yīng)的主要中間產(chǎn)物；不論是FAD半醌(FADH·),還是空氣穩(wěn)定半醌(FAD-FMNH·)均不

3、能與阿霉素迅速反應(yīng)。這些實驗數(shù)據(jù)說明,在Ca2+/CaM存在的條件下,單電子受體Adr主要從FMN處接受電子；雙電子還原半醌(FADH2/FMN和FAD/FMNH2),和三電子還原半醌(FADH2/FMNH·和FADH·/FMNH2)是反應(yīng)中的活性形式,均可以迅速傳遞單電子給電子受體。總結(jié)以上實驗結(jié)果,得出以下結(jié)論：我們構(gòu)建的表達系和純化方法適用于表達hnNOS；hnNOS在醌類藥物的生物轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用；Ca2+/CaM通過促