中間絲蛋白nestin（巢蛋白）在急性腎損傷中的表達(dá)及機制研究.pdf

1、急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是指數(shù)小時或數(shù)日內(nèi)發(fā)生的由于腎小球濾過率(Glomerular Filtration Rate,GFR)急速下降而導(dǎo)致的臨床常見綜合征，其臨床轉(zhuǎn)歸中部分患者會進(jìn)展到慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)即“AKI to CKD”、“CKD基礎(chǔ)上AKI”(Acute on Chronic Kidney Diseases,A on C)[1]、甚至終末期

2、腎衰（End-stage Renal Disease,ESRD）即“AKI to ESRD”[2,3]，是必須引起臨床醫(yī)生關(guān)注的常見危重疾病之一。本課題在急性腎損傷領(lǐng)域的研究聚焦在中間絲蛋白-巢蛋白,一種在神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的潛在干細(xì)胞標(biāo)志物，研究其在急性腎損傷進(jìn)程中的表達(dá)調(diào)控機制，為AKI的基礎(chǔ)研究提供新的研究方向和治療靶點。
　　本課題組的前期工作通過建立腎臟腎臟缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)

3、誘導(dǎo) AKI模型和順鉑(Cisplatin,CIS)腎毒性藥物誘導(dǎo)大鼠 AKI模型,對大鼠的尿液樣本進(jìn)行同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)（iTRAQ-4）試劑標(biāo)記，并進(jìn)行高效液相色譜（LC-MS/MS）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MAIDI-TOF/TOF）分析。以探索動物模型尿液中各種標(biāo)志物的表達(dá)，最終確定一種中間絲蛋白--巢蛋白,可作為一種新穎的生物標(biāo)志物預(yù)測早期AKI的發(fā)生、發(fā)展，具有重要研究價值。
　　在前期研究的工作

4、基礎(chǔ)上，本課題第一部分通過建立腎臟缺血再灌注致AKI模型(n=24)在手術(shù)后2h、6h、1d、2d、3d、4d、5d、7d為時間截點收取標(biāo)本；順鉑誘導(dǎo)AKI模型(n=27)在給藥后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d、9 d、11 d、14 d為時間截點收取標(biāo)本。通過病理染色(包括HE,PAS,Masson)發(fā)現(xiàn)AKI大鼠腎臟組織出現(xiàn)典型的急性小管壞死（Acute Tubular Necrosis,ATN）形態(tài)學(xué)改變，并根據(jù)小

5、管損傷病理評分從管型、小管細(xì)胞退行性變（刷狀緣消失、核改變、空泡樣變、PAS陽性顆粒、空腔內(nèi)細(xì)胞碎）、細(xì)胞丟失三方面進(jìn)行評分。通過高效液相色譜法,我們發(fā)現(xiàn)血清肌酐的變化可在一定程度上反應(yīng)急性腎損傷的病程轉(zhuǎn)歸。利用免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)等免疫學(xué)技術(shù)，證實巢蛋白在正常腎臟位于腎小球表達(dá)，但在AKI發(fā)生后亦表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，并且與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等病理變化呈正相關(guān)(P<0.05)。巢蛋白在急性損傷的小管上皮細(xì)胞中再次增強表達(dá)，可同時與同

6、一中間絲蛋白家族(IFs)中的細(xì)胞去分化標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)標(biāo)記共定位，并且兩種IFs的轉(zhuǎn)錄翻譯水平在疾病過程中持續(xù)增高,說明巢蛋白在 AKI中的再次表達(dá)增高可能與細(xì)胞分化狀態(tài)改變相關(guān)。腎臟缺血再灌注誘導(dǎo) AKI模型中巢蛋白在72 h表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);順鉑誘導(dǎo)AKI模型中巢蛋白在D10表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)急性腎損傷的兩種常見病因，腎臟缺血再灌注和順鉑誘導(dǎo)急性小管間質(zhì)損傷的病程表現(xiàn)不同，這與兩者

7、不同的致病機制相關(guān)。
　　第二部分我們進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞實驗的機制研究，利用低氧和H202刺激、cisplatin(腎毒性化療藥物)對人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)進(jìn)行體外刺激以模擬上述動物模型的致病機制，利用Sh RNA基因沉默及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)改變HK-2細(xì)胞內(nèi)nestin的表達(dá)水平，進(jìn)行雙向基因調(diào)控分析。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝表達(dá)質(zhì)粒增強轉(zhuǎn)染效率。相關(guān)實驗結(jié)果顯示低氧誘導(dǎo)24h巢蛋白出現(xiàn)表達(dá)，順鉑刺激(20μM)16h時巢蛋白出現(xiàn)

8、表達(dá)。在正常細(xì)胞、沉默巢蛋白表達(dá)的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞分別經(jīng)過低氧誘導(dǎo)和藥物刺激后，沉默基因組細(xì)胞凋亡計數(shù)明顯高于正常對照組及未刺激同組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；在基因過表達(dá)組細(xì)胞凋亡計數(shù)呈逆轉(zhuǎn)狀態(tài)，高于刺激模型組間正常對照及空載體組(P<0.05)，并與未刺激同組無差異。沉默基因組細(xì)胞遷移能力明顯低于同時經(jīng)過低氧及藥物刺激的正常對照及空載體組(P<0.05)?；蜻^表達(dá)組細(xì)胞 SOD（超氧化物歧化酶）水平上調(diào)，高于經(jīng)過低氧誘導(dǎo)

9、的正常對照及空載體組(P<0.05)，在藥物刺激組尚無統(tǒng)計學(xué)差異。上述實驗結(jié)果說明巢蛋白在急性損傷小管中的再次表達(dá)，可能作為一個保護(hù)因素，逆轉(zhuǎn)缺氧和毒性藥物引起的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并與細(xì)胞遷移能力相關(guān)。
　　綜上所述，本研究通過體內(nèi)及體外實驗證實巢蛋白nestin，新定義的第IV類中間絲蛋白，在AKI腎小管上皮細(xì)胞中逐漸表達(dá)且其表達(dá)水平與細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度相關(guān)，并與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，參與細(xì)胞去分化狀態(tài)的改變。巢蛋白在急性