中間絲蛋白nestin（巢蛋白）在急性腎損傷中的表達及機制研究.pdf

1、急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是指數(shù)小時或數(shù)日內發(fā)生的由于腎小球濾過率(Glomerular Filtration Rate,GFR)急速下降而導致的臨床常見綜合征，其臨床轉歸中部分患者會進展到慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)即“AKI to CKD”、“CKD基礎上AKI”(Acute on Chronic Kidney Diseases,A on C)[1]、甚至終末期

2、腎衰（End-stage Renal Disease,ESRD）即“AKI to ESRD”[2,3]，是必須引起臨床醫(yī)生關注的常見危重疾病之一。本課題在急性腎損傷領域的研究聚焦在中間絲蛋白-巢蛋白,一種在神經病學領域備受關注的潛在干細胞標志物，研究其在急性腎損傷進程中的表達調控機制，為AKI的基礎研究提供新的研究方向和治療靶點。
　　本課題組的前期工作通過建立腎臟腎臟缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)

3、誘導 AKI模型和順鉑(Cisplatin,CIS)腎毒性藥物誘導大鼠 AKI模型,對大鼠的尿液樣本進行同位素相對標記與絕對定量技術（iTRAQ-4）試劑標記，并進行高效液相色譜（LC-MS/MS）和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MAIDI-TOF/TOF）分析。以探索動物模型尿液中各種標志物的表達，最終確定一種中間絲蛋白--巢蛋白,可作為一種新穎的生物標志物預測早期AKI的發(fā)生、發(fā)展，具有重要研究價值。
　　在前期研究的工作

4、基礎上，本課題第一部分通過建立腎臟缺血再灌注致AKI模型(n=24)在手術后2h、6h、1d、2d、3d、4d、5d、7d為時間截點收取標本；順鉑誘導AKI模型(n=27)在給藥后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d、9 d、11 d、14 d為時間截點收取標本。通過病理染色(包括HE,PAS,Masson)發(fā)現(xiàn)AKI大鼠腎臟組織出現(xiàn)典型的急性小管壞死（Acute Tubular Necrosis,ATN）形態(tài)學改變，并根據(jù)小

5、管損傷病理評分從管型、小管細胞退行性變（刷狀緣消失、核改變、空泡樣變、PAS陽性顆粒、空腔內細胞碎）、細胞丟失三方面進行評分。通過高效液相色譜法,我們發(fā)現(xiàn)血清肌酐的變化可在一定程度上反應急性腎損傷的病程轉歸。利用免疫組化和免疫熒光雙標等免疫學技術，證實巢蛋白在正常腎臟位于腎小球表達，但在AKI發(fā)生后亦表達于腎小管上皮細胞，并且與細胞凋亡、細胞增殖等病理變化呈正相關(P<0.05)。巢蛋白在急性損傷的小管上皮細胞中再次增強表達，可同時與同

6、一中間絲蛋白家族(IFs)中的細胞去分化標志物波形蛋白(vimentin)標記共定位，并且兩種IFs的轉錄翻譯水平在疾病過程中持續(xù)增高,說明巢蛋白在 AKI中的再次表達增高可能與細胞分化狀態(tài)改變相關。腎臟缺血再灌注誘導 AKI模型中巢蛋白在72 h表達顯著上調(P<0.05);順鉑誘導AKI模型中巢蛋白在D10表達顯著上調(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)急性腎損傷的兩種常見病因，腎臟缺血再灌注和順鉑誘導急性小管間質損傷的病程表現(xiàn)不同，這與兩者

7、不同的致病機制相關。
　　第二部分我們進一步進行體外細胞實驗的機制研究，利用低氧和H202刺激、cisplatin(腎毒性化療藥物)對人腎小管上皮細胞(HK-2)進行體外刺激以模擬上述動物模型的致病機制，利用Sh RNA基因沉默及質粒轉染技術改變HK-2細胞內nestin的表達水平，進行雙向基因調控分析。利用逆轉錄病毒載體包裝表達質粒增強轉染效率。相關實驗結果顯示低氧誘導24h巢蛋白出現(xiàn)表達，順鉑刺激(20μM)16h時巢蛋白出現(xiàn)

8、表達。在正常細胞、沉默巢蛋白表達的細胞、轉染質粒的細胞分別經過低氧誘導和藥物刺激后，沉默基因組細胞凋亡計數(shù)明顯高于正常對照組及未刺激同組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；在基因過表達組細胞凋亡計數(shù)呈逆轉狀態(tài)，高于刺激模型組間正常對照及空載體組(P<0.05)，并與未刺激同組無差異。沉默基因組細胞遷移能力明顯低于同時經過低氧及藥物刺激的正常對照及空載體組(P<0.05)?；蜻^表達組細胞 SOD（超氧化物歧化酶）水平上調，高于經過低氧誘導

9、的正常對照及空載體組(P<0.05)，在藥物刺激組尚無統(tǒng)計學差異。上述實驗結果說明巢蛋白在急性損傷小管中的再次表達，可能作為一個保護因素，逆轉缺氧和毒性藥物引起的細胞凋亡和氧化應激，并與細胞遷移能力相關。
　　綜上所述，本研究通過體內及體外實驗證實巢蛋白nestin，新定義的第IV類中間絲蛋白，在AKI腎小管上皮細胞中逐漸表達且其表達水平與細胞損傷嚴重程度相關，并與細胞凋亡和細胞增殖呈正相關，參與細胞去分化狀態(tài)的改變。巢蛋白在急性