Corin在急性腎損傷中的作用.pdf

1、目的：急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，具有很高的發(fā)病率和死亡率。引發(fā)AKI的因素有很多，比如腎低灌注、腎毒性藥物、外科手術(shù)以及敗血癥等等。而在許多臨床手術(shù)中腎缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎功能衰竭的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，比如腎臟移植、主動(dòng)脈的心臟搭橋手術(shù)以及心肺的外科手術(shù)等。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)住院人群中20％患有急性腎損傷，而ICU病房中急性腎損傷的患病率高達(dá)40％-60％，但臨床上目前并沒(méi)有有效

2、的治療方法，因此開(kāi)發(fā)新型的預(yù)防和治療急性腎損傷的策略迫在眉睫。Corin是一種新近發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，其結(jié)構(gòu)是由一個(gè)短的氨基末端胞漿區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和胞外區(qū)組成，胞外區(qū)含有兩個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)域、八個(gè)低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域、一個(gè)清道夫受體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胰蛋白酶樣的蛋白酶結(jié)構(gòu)域，其主要表達(dá)于心臟，主要功能是通過(guò)將心鈉肽前體切割活化成有活性的ANP，進(jìn)而調(diào)節(jié)血壓和心臟功能。但近期發(fā)現(xiàn)Corin也表達(dá)于腎臟的腎小管中，那么Corin在腎小管病變的

3、急性腎損傷中是否起到作用，我們無(wú)從得知。有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，基因變異和功能障礙導(dǎo)致Corin的活性降低，可能與一系列心血管疾病如心肌肥厚、高血壓的發(fā)病有關(guān)，所以Corin在腎缺血再灌注損傷中的作用更值得我們?nèi)ヌ接懞脱芯俊?br>　　方法：⑴腎缺血再灌注損傷小鼠模型的構(gòu)建及檢測(cè)Corin的表達(dá)情況選取9周齡的野生型（wild type，WT）C57BL/6小鼠，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，沿中線切開(kāi)腹腔，用動(dòng)脈夾夾住雙側(cè)腎蒂45分鐘，45分鐘后去掉

4、動(dòng)脈夾，在雙腎上滴上37℃生理鹽水，觀察灌注情況，確保血液復(fù)流，然后開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在24h、48h、72h時(shí)處死小鼠取材。分別用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot，WB)、Real-timeRT-PCR以及免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)Corin在腎缺血再灌注損傷模型小鼠腎臟組織中的表達(dá)變化情況。⑵Corin在多種腎小管中的表達(dá)情況采用組織免疫熒光(immunofluoresce，IF)的

5、方法同時(shí)對(duì)Corin以及腎小管不同部位標(biāo)記物蛋白進(jìn)行熒光雙染共定位。⑶體外細(xì)胞模型構(gòu)建及檢測(cè)Corin表達(dá)情況體外培養(yǎng)人的腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），采用低氧培養(yǎng)箱培育1.5小時(shí)后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)的方法，體外模擬腎缺血再灌注模型。采用Western Blot和Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)Corin在HK-2細(xì)胞中的變化情況。⑷野生型小鼠與Corin-/-小鼠腎臟功能學(xué)指標(biāo)對(duì)比下腔靜脈取血，檢測(cè)血清中肌酐尿素氮的含量。⑸野生型小

6、鼠與Corin-/-小鼠腎臟形態(tài)學(xué)損傷對(duì)比用蘇木素-伊紅染色的方法(hematoxylin-eosin staining，H&E)對(duì)野生型小鼠和Corin-/-小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行染色，然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)損傷評(píng)分。用TUNEL對(duì)野生型和Corin-/-小鼠腎臟組織石蠟切片就行熒光染色，檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況。⑹用免疫組化的方法對(duì)野生型小鼠和Corin-/-小鼠腎臟組織石蠟切片染色，Ly6B標(biāo)記中性粒細(xì)胞、CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞。⑺用Real-t

7、ime RT-PCR的方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)Corin后HK-2細(xì)胞在低氧低糖條件下炎癥因子的變化情況。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)Corin后HK-2細(xì)胞在低氧低糖條件下凋亡的變化情況。⑻用Western Blot的方法，檢測(cè)腎臟勻漿中β-catenin的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①Corin在腎缺血再灌注小鼠模型中的表達(dá)水平顯著降低 Real-time RT-PCR和Western Blot檢測(cè)小鼠腎臟中Corin的表達(dá)，結(jié)果表明在蛋白和mR

8、NA水平模型組中Corin的表達(dá)明顯比假手術(shù)中降低。免疫組化結(jié)果也印證了Corin的表達(dá)在腎臟組織中是顯著降低的。②Corin主要表達(dá)于腎臟的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管中免疫熒光結(jié)果表明，Corin主要表達(dá)于腎臟的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管中，髓質(zhì)的集合管中表達(dá)較少。③體外模擬條件下Corin的表達(dá)含量顯著降低用Real-time RT-PCR和Western Blot檢測(cè)低氧低糖處理的HK-2細(xì)胞中Corin的表達(dá)顯著降低。④Corin的缺失加重了腎

9、缺血再灌注的損傷 Corin的缺失導(dǎo)致血清中的肌酐尿素氮顯著升高、腎臟的損傷更重、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增加、細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多。⑤過(guò)表達(dá)Corin后低氧低糖條件下的HK-2凋亡減少、炎癥反應(yīng)降低 HK-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)Corin后，在低氧低糖的條件下用細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯減少，用Real-time PT-PCR檢測(cè)細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯降低。⑥腎缺血再灌損傷后激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使β-catenin的表達(dá)