中間絲蛋白Nestin在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分、中間絲蛋白Nestin在間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中表達(dá)的研究
　　 背景：腎小管間質(zhì)纖維化是一系列慢性。腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的決定性因素之一，腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-myofibroblast transition，EMT)在間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮了重要的致病作用。巢蛋白(Nestin)屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，可能在各種細(xì)胞骨架蛋白中起橋梁作用，參與調(diào)節(jié)整個(gè)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的

2、穩(wěn)定。我們先前的研究于國內(nèi)外率先發(fā)現(xiàn)：在腎臟發(fā)育階段，Nestin-過性表達(dá)于分化未成熟的小管上皮細(xì)胞，而在分化成熟的小管上皮細(xì)胞中再無表達(dá)。腎間質(zhì)纖維化時(shí)，由于EMT過程涉及腎小管上皮細(xì)胞的去分化以及細(xì)胞形態(tài)和遷移能力的改變，因而腎小管發(fā)育階段曾表達(dá)的Nestin有可能重新表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞并發(fā)揮一定的作用。因此，我們通過構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)的腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，觀察腎小管EMT過程中是否出現(xiàn)Nestin的表達(dá)。
　

3、　 方法：選用60只200—250g雄性SD大鼠，建立UUO動(dòng)物模型，以假手術(shù)大鼠為對照，分別于手術(shù)后3天、6天、11天和14天處死大鼠。Masson染色觀察大鼠間質(zhì)纖維化情況，免疫組化法檢測大鼠TGFβ1、上皮細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物E-鈣粘蛋白、肌成纖維細(xì)胞表型標(biāo)志物.平滑肌肌動(dòng)蛋白α(αSMA)及Nestin在腎臟的表達(dá)；免疫熒光共染色檢測Nestin和E-鈣粘蛋白/αSMA表達(dá)的關(guān)系；實(shí)時(shí)定量PCR法檢測大鼠皮質(zhì)Nestin mR

4、NA水平；Western blot法檢測Nestin、E-鈣粘蛋白和αSMA的蛋白水平；Pearson法分析Nestin改變與皮質(zhì)間質(zhì)容量分?jǐn)?shù)及E-鈣粘蛋白、αSMA蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：與對照大鼠比，隨著輸尿管梗阻時(shí)間的延長，大鼠腎間質(zhì)纖維化面積逐漸增加，術(shù)后3天為2.1％，6天達(dá)到12.2％，11天時(shí)為18.0％，14天間質(zhì)有近30％的面積出現(xiàn)纖維化，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO大鼠的間質(zhì)和小管內(nèi)出現(xiàn)TG

5、Fβ1的表達(dá)。與此同時(shí)，隨梗阻時(shí)間延長，UUO大鼠腎小管上皮表型E-鈣粘蛋白表達(dá)下降，11天時(shí)下降明顯，14天時(shí)表達(dá)量幾乎無法檢測到(UUO11d0.34±0.041，UUO14d0.02±0.007 vs CON1.19±0.087，P<0.05)；肌成纖維細(xì)胞表型αSMA自術(shù)后3天即呈時(shí)間依賴性增加(與對照比P<0.05)。大鼠小管EMT的同時(shí)，間質(zhì)和小管部位先后出現(xiàn)Nestin的表達(dá)，熒光染色顯示UUO6天時(shí)大鼠Nestin表達(dá)于

6、E-鈣粘蛋白缺失的小管上皮，并部分與αSMA共表達(dá)。隨手術(shù)時(shí)間延長，Nestin mRNA和蛋白水平均呈時(shí)間依賴性增加。Nestin蛋白水平與間質(zhì)纖維化程度(r=0.816，P<0.05)及αSMA蛋白水平(r=0.97，P<0.05)呈正相關(guān)，與E-鈣粘蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.816，P<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)在UUO間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型中，存在著腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化；(2)伴隨著EMT的發(fā)生，分化未成熟小管上皮

7、細(xì)胞標(biāo)志物Nestin再次表達(dá)；(3)Nestin的表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化程度及細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物的改變密切相關(guān)。
　　 第二部分、Nestin在體外培養(yǎng)的人近端小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的研究
　　 背景：腎小管上皮細(xì)胞是腎臟中生理功能最活躍的細(xì)胞之一，各種損傷因素，如缺血、缺氧、蛋白尿以及免疫炎癥均可導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞的損傷，損傷的小管上皮細(xì)胞發(fā)生活化，其細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移、吞噬等能力顯著增強(qiáng)。而腎小管上皮細(xì)胞在組織發(fā)生過程中與間

8、質(zhì)成纖維細(xì)胞具有同源性，在一定的病理?xiàng)l件下可以發(fā)生上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，直接參與腎間質(zhì)纖維化損傷過程。Nestin作為中間絲蛋白的一種，在調(diào)控整個(gè)細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中具有一定的作用，在腎臟發(fā)育早期，Nestin表達(dá)于分化未成熟的小管上皮細(xì)胞，參與其分化過程。我們前一部分的動(dòng)物研究已經(jīng)證實(shí)，分化未成熟小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物Nestin在腎間質(zhì)纖維化小管EMT的過程中再次表達(dá)。因此，本部分研究將以體外培養(yǎng)的人近端小管上皮細(xì)胞(

9、HKC)為觀察對象，用TGFβ1誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)分化，體外驗(yàn)證小管EMT時(shí)，Nestin是否重新表達(dá)及其與腎小管上皮細(xì)胞去分化表型改變及細(xì)胞遷移能力的關(guān)系。
　　 方法：體外人近端小管上皮細(xì)胞(HKC)培養(yǎng)，以5ng/l轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)干預(yù)不同時(shí)間，以非干預(yù)組為對照。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測Nestin mRNA水平，免疫熒光法及Western blot法檢測Nestin、E-鈣粘蛋白、αSMA的表達(dá)，Transwell遷移實(shí)

10、驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。
　　 結(jié)果：YGFβ1干預(yù)HKC72小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石樣變?yōu)殚L梭形。E-鈣粘蛋白呈時(shí)間依賴性下調(diào)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)后分別比未干預(yù)組下降25.7％，62.0％，84.2％和92.8％(P<0.05)，而48小時(shí)后，E-鈣粘蛋白表達(dá)完全缺失；基礎(chǔ)狀態(tài)下，HKC內(nèi)無αSMA表達(dá)，TGFβ1干預(yù)36小時(shí)后，HKC中可檢測到αSMA蛋白表達(dá)陽性，提示體外培養(yǎng)的HKC發(fā)生轉(zhuǎn)分化。轉(zhuǎn)分化后HKC

11、細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)，為對照細(xì)胞的15.37倍(P<0.05)。Nestin的mRNA水平自TGFβ1作用6小時(shí)后，即出現(xiàn)上調(diào)，比對照組增加了17.2％(P=0.04)，隨TGFβ1作用時(shí)間的延長，Nestin mRNA的水平呈時(shí)間依賴性增加；Nestin的蛋白水平自24小時(shí)起開始增加，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)分別比對照組增加了14.6％、95.5％、104.1％和100.8％(與對照組相比，P<0.05)。Nestin蛋

12、白表達(dá)的出現(xiàn)要早于E-鈣粘蛋白表達(dá)的完全缺失及αSMA蛋白的表達(dá)的出現(xiàn)。
　　 結(jié)論：(1)TGFβ1可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HKC轉(zhuǎn)分化，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞表型E-鈣粘蛋白的下調(diào)和肌成纖維細(xì)胞表型αSMA的出現(xiàn)及細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)；(2)HKC轉(zhuǎn)分化的同時(shí)，分化未成熟小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物Nestin再次表達(dá)，其蛋白表達(dá)早于上皮表型E-鈣粘蛋白的缺失及肌成纖維細(xì)胞表型αSMA的出現(xiàn)。
　　 第三部分：Nestin對體外培養(yǎng)的腎小管上

13、皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后細(xì)胞遷移能力的影響
　　 背景：正常情況下，腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞由腎小管基底膜分隔開來，因此，轉(zhuǎn)分化的小管上皮細(xì)胞只有具備了一定的遷移能力才能突破基底膜進(jìn)入腎間質(zhì)。我們前一部分的研究采用Transwell技術(shù)證實(shí)，體外培養(yǎng)的HKC經(jīng)TGFβ1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化后細(xì)胞的遷移能力增加。以往的研究顯示，細(xì)胞遷移能力的改變與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)的重組密切相關(guān)。而Nestin是一種結(jié)構(gòu)特殊的第Ⅵ類中間絲蛋白，有可能在各種細(xì)胞

14、骨架蛋白中起橋梁作用，參與調(diào)節(jié)整個(gè)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此，本部分的研究將通過RNA干擾技術(shù)，下調(diào)Nestin的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而觀察Nestin對于HKC轉(zhuǎn)分化細(xì)胞特異性表型的表達(dá)及細(xì)胞遷移能力的影響，探討Nestin參與EMT的可能機(jī)制。
　　 方法：構(gòu)建靶向Nestin并帶有U6啟動(dòng)子和編碼綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因的短發(fā)夾狀雙鏈RNA的真核表達(dá)質(zhì)粒(shRNA-Nestin)，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HKC。觀察TGFβ

15、1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化后HKC細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物的表達(dá)及細(xì)胞遷移能力的改變。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染shRNA-Nestin干擾質(zhì)粒后能一定程度抑制轉(zhuǎn)分化后HKC內(nèi)Nestin蛋白表達(dá)，抑制率為35％左右(與對照質(zhì)粒相比，P<0.05)。下調(diào)Nestin的表達(dá)并不改變E-鈣粘蛋白表達(dá)減少的趨勢及αSMA表達(dá)增加的趨勢(與對照質(zhì)粒和非轉(zhuǎn)染組相比，P均>0.05)，但是下調(diào)Nestin表達(dá)后能導(dǎo)致轉(zhuǎn)分化后細(xì)胞遷移能力明顯下降(128.40±12.

16、4 vs非轉(zhuǎn)染組193.73±13.51細(xì)胞/視野，P<0.05)，抑制率為33.72％。而轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的HKC細(xì)胞遷移能力無明顯改變(189.97±11.96 vs非轉(zhuǎn)染組193.73±13.51細(xì)胞/視野，P>0.05)。
　　 結(jié)論：Nestin通過影響轉(zhuǎn)分化后HKC細(xì)胞的遷移能力參與了腎小管EMT的動(dòng)態(tài)進(jìn)展過程，這將為闡明腎間質(zhì)纖維化過程中小管EMT的細(xì)胞分子機(jī)制，進(jìn)而全方位阻斷慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展提供新的研究和治療