甲硝唑獸藥殘留酶聯(lián)免疫分析方法.pdf

1、論文針對(duì)動(dòng)物源性食品中甲硝唑及其結(jié)構(gòu)類似物的非法添加，研究并建立了系統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
　　對(duì)于甲硝唑，從其結(jié)構(gòu)類似物1-(2-氨乙基)-甲基-5-硝基咪唑二鹽酸鹽出發(fā)合成半抗原，通過(guò)戊二醛一步法使其咪唑環(huán)上的氨基直接與載體蛋白連接。從其本身出發(fā)合成半抗原采用了琥珀酸酐及氯乙酸乙酯法及Linker法。對(duì)于Linker法，選擇牛甲狀腺素蛋白作為載體蛋白并使其先與2，2-(乙烯二氧)雙（乙胺）連接，接著使用甲硝唑與N-N二琥珀酰亞

2、胺基碳酸酯連接，最后兩者繼續(xù)進(jìn)行連接形成一個(gè)超長(zhǎng)鏈完全抗原。對(duì)于琥珀酸酐及氯乙酸乙酯修飾半抗原法，采用琥珀酸酐連接法使甲硝唑與載體蛋白之間連接上一個(gè)7原子長(zhǎng)度的鏈等。以上種種方法共制備出10種完全抗原。
　　按照不同的免疫方案免疫新西蘭大耳白兔，最后由戊二醛法制備的完全抗原得到高特異性和高靈敏度的多克隆抗體。利用混合酸酐法將由甲硝唑制備出的半抗原MSA與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)制備酶標(biāo)。通過(guò)優(yōu)化包被抗體量、酶標(biāo)稀釋倍數(shù)、封閉液、緩沖液p

3、H、發(fā)光底物溶液和發(fā)光酶標(biāo)板，建立了直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法與化學(xué)發(fā)光直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法CLEIA。直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法對(duì)甲硝唑的靈敏度(IC50)為0.30±0.04μg/mL，檢出限(IC15)為0.036±0.003μg/mL。建立的CLEIA方法對(duì)甲硝唑靈敏度(IC50)為0.022±0.004μg/mL，檢出限(IC15)為0.004±0.0003μg/mL。
　　在直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法中對(duì)于二甲硝基咪唑、替硝唑、奧硝唑的交叉反應(yīng)

4、率為194％、76％、115％，說(shuō)明本文建立的方法除了可以檢測(cè)甲硝唑獸藥殘留外，可以同時(shí)檢測(cè)其他三種硝基咪唑類藥物多殘留。選擇雞肉、蝦樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，樣品被分別添加了濃度為1.2μg/g、6μg/g、20μg/g的甲硝唑，經(jīng)過(guò)基質(zhì)影響的消除后應(yīng)用所建立的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，回收率在58.54％到111.64％之間。
　　本研究建立的兩種檢測(cè)方法靈敏度高，特異性好，適合多種禽類及水產(chǎn)品中甲硝唑及硝基咪唑類藥物多殘留的快速檢