天山根瘤菌MsiR蛋白調(diào)控機(jī)理的研究.pdf

1、中慢生型天山根瘤菌能夠在甘草的根部共生結(jié)瘤固氮，提供植物生長所需的氮源。這種共生關(guān)系的建立依賴于根瘤菌與宿主植物之間復(fù)雜的信息交流。在甘草萌發(fā)初期，其分泌的抗菌物質(zhì)刀豆氨酸能夠殺死植株周圍可能的有害細(xì)菌，而在天山根瘤菌中存在著刀豆氨酸的外運(yùn)系統(tǒng)MsiAR系統(tǒng)，使其在甘草根際選擇性的環(huán)境下繼續(xù)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)菌群，為后來的結(jié)瘤共生提供有力條件。
　　MsiR蛋白，屬于LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族成員，能夠啟動(dòng)msiA基因的表達(dá)，刀豆氨酸作為輔

2、助誘導(dǎo)物。LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白是原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白中最大的一類家族蛋白，參與調(diào)控的基因類型多種多樣，包括毒力、代謝、群體感應(yīng)和游動(dòng)性等多種功能基因。本文以MsiR為主要研究對(duì)象，探究MsiR對(duì)msiA基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，豐富對(duì)LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的價(jià)值。
　　為研究MsiR對(duì)msiA的調(diào)控機(jī)制，將MsiR在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)及純化。通過EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)MsiR蛋白與啟動(dòng)子DNA的結(jié)合，加入刀豆氨酸

3、能增強(qiáng)這種結(jié)合。與此同時(shí)，通過等溫量熱滴定確定了刀豆氨酸與MsiR之間存在相互作用，刀豆氨酸與MsiR結(jié)合的化學(xué)計(jì)量數(shù)為1，Kd值為1.86μM。
　　通過5'race實(shí)驗(yàn)確定了msiA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并由此推測(cè)了-10區(qū)和-35區(qū)。采用啟動(dòng)子長度步移及定點(diǎn)突變確定了影響MsiR轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的5個(gè)重要位點(diǎn):RBS-1(-70,-67)、RBS-2(-59,-56)、 ABS-1(-50,-47)、 ABS-2(-41,-37)

4、、ABS-3(-30，-27)，并由此預(yù)測(cè)了MsiR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型:
　　無刀豆氨酸存在的情況下，MsiR以四聚體形式存在，并呈現(xiàn)出開放型的構(gòu)象，其結(jié)合到msiA調(diào)控區(qū)的RBS-1、RBS-2、ABS-2、ABS-3位點(diǎn)。此時(shí)，DNA的彎曲角度較緩，MsiR遮住了msiA啟動(dòng)子的-35區(qū)，使RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA結(jié)合效率大大降低，基因的表達(dá)水平處于極低的狀態(tài)。
　　在加入了刀豆氨酸以后MsiR仍以四聚體形式存在，但轉(zhuǎn)