CA16疫苗候選株減毒特性及生產(chǎn)工藝的初步研究.pdf

1、手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一種在全球范圍內(nèi)流行的急性傳染病，近幾年來，其在亞太地區(qū)的爆發(fā)尤為嚴(yán)重。在我國，手足口病已成為危害嬰幼兒健康的重要公共衛(wèi)生問題。
　　柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起手足口病的主要病原體。一直以來，研究人員把工作重點(diǎn)放在了致病率和致死率更高的EV71上，而

2、目前越來越多的研究表明CA16的感染也是導(dǎo)致重癥及死亡病例的重要因素之一。但是目前還沒有針對(duì)CA16引起的手足口病的特效治療方案和預(yù)防手段。疫苗是控制手足口病的關(guān)鍵，本研究對(duì)CA16候選株減毒特性和生產(chǎn)工藝進(jìn)行初步的研究，旨在為其減毒疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)將兩株CA16高免疫原性的毒株經(jīng)過連續(xù)低溫傳代減毒后，進(jìn)行減毒特性的評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)33℃連續(xù)低溫傳代后毒株表現(xiàn)出以下特性(1)減毒候選株保持穩(wěn)定的生長特性，低溫傳至第11

3、代次后KM154株的感染性滴度波動(dòng)范圍小于0.5LgCCID50/ml;(2)減毒候選株具有良好的免疫原性，以病毒收獲液0.5ml/只的劑量腹腔注射免疫成鼠后以抗體效價(jià)大于1∶4為陽性，其抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)100％，從抗體幾何平均滴度(Genometric Mean Titer，GMT)來看，最高可達(dá)1∶30;(3)減毒候選株的致病性研究中發(fā)現(xiàn)隨著代次的升高減毒株對(duì)乳鼠的致病力減弱，KM154毒株的第12代次(KP12)后感染的乳鼠未見發(fā)病及

4、死亡情況，組織中能檢測(cè)到CA16病毒，但無明顯的病理改變;(4)減毒候選株基因序列檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初始代次相比，毒株基本保持了遺傳的穩(wěn)定性;(5)交叉保護(hù)研究結(jié)果顯示，候選株免疫兔后制成的兔抗-CA16血清對(duì)所選的14株CA16毒株具有100％的保護(hù)作用，而15株EV71株只有一株受保護(hù);(6)在感染了兩個(gè)減毒候選株的ICR成鼠（腹腔注射）及乳鼠（顱內(nèi)注射）的腦、脾、腎、肺、肝、心、肌肉、脊髓組織中檢測(cè)到CA16病毒，表明病毒能在乳鼠及

5、成鼠組織內(nèi)復(fù)制并傳播。
　　本研究還對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行了初步的探討。(1)在毒株穩(wěn)定性影響因素的研究中我們發(fā)現(xiàn)，10次以內(nèi)的凍融次數(shù)對(duì)CA16毒株的感染性滴度無影響;毒株在-70℃與液氮中儲(chǔ)存8個(gè)月后，兩個(gè)條件下的毒株感染性滴度相同，均為6.58LgCCID50/ml，與原始相比，基本沒有下降;(2)加入MgCl2和我所甲肝無明膠的凍干保護(hù)劑后毒株的感染性滴度下降速率明顯減緩，加入0.5 M MgCl2組至第7天只下降了1.4LgCC

6、ID50/ml。(3)不同純化工藝的探討中我們發(fā)現(xiàn)氯仿抽提對(duì)病毒的感染性滴度及抗原含量回收率都較好，且刺激小鼠產(chǎn)生有效的抗體水平，是較理想的病毒純化方法;實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量及減毒株感染性滴度對(duì)毒株的免疫原性都有影響，蛋白質(zhì)含量及感染性滴度高的毒株免疫原性好。
　　本研究獲得了具有穩(wěn)定生長特性、良好免疫原性和遺傳穩(wěn)定性，且擁有對(duì)CA16廣譜保護(hù)作用的CA16減毒候選株，并對(duì)毒株熱穩(wěn)定性、純化方法等生產(chǎn)工藝進(jìn)行了初步摸索，為CA16