重組EV71、CA16型手足口病雙價(jià)VLP疫苗的初步研究.pdf

1、目的:運(yùn)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)重組EV71、CA16病毒樣顆粒（Virus-like particle，VLP），對(duì)重組EV71、CA16雙價(jià)VLP疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為發(fā)展安全、有效、具有保護(hù)作用的手足口病新型疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　方法:（1）通過測(cè)序分別獲得構(gòu)建EV71、CA16 VLP所必需的疫苗候選株基因P1、3CD片段序列，首先根據(jù)昆蟲密碼子偏愛性選擇優(yōu)勢(shì)密碼子，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)

2、對(duì)EV71、CA16 P1和3CD基因進(jìn)行設(shè)計(jì)和全基因合成。將合成后的P1、3CD序列構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pFastBacDual上，通過位點(diǎn)特異性重組篩選陽性重組菌DH10BacTM E.coli，將EV71、CA16的重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9獲得重組桿狀病毒；通過透射電鏡、間接免疫熒光、SDS-PAGE、Western blot對(duì)純化的重組EV71、CA16 VLP蛋白抗原進(jìn)行鑒定。（2）將純化后的重組目的蛋白，聯(lián)合使用Al

3、(OH)3佐劑，采用腹腔注射的途徑免疫4-6周齡ICR小鼠，于0d、14d對(duì)小鼠進(jìn)行兩次免疫，一免10d和二免10d后采集小鼠尾靜脈血，二免14d后取小鼠脾臟。通過間接ELISA法檢測(cè)血清 IgG抗體效價(jià)、血清抗體亞型分布及ELISPOT等方法比較重組 EV71、CA16單價(jià)及雙價(jià)VLP疫苗免疫原性；通過體外微量中和試驗(yàn)比較重組EV71、CA16單價(jià)及雙價(jià)VLP疫苗對(duì)現(xiàn)有EV71、CA16流行株的保護(hù)作用；將EV71、CA16單價(jià)及雙價(jià)

4、VLP疫苗免疫 ICR乳母鼠，用EV71、CA16強(qiáng)毒株攻擊其新生5日齡乳鼠，觀察乳鼠體重變化及存活率，綜合比較重組EV71、CA16單價(jià)及雙價(jià) VLP疫苗的免疫保護(hù)效果。
　　結(jié)果:（1）經(jīng)SDS-PAGE、Western blot以及間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果均證明了EV71、CA16 VLP的表達(dá)，透射電鏡觀察可見直徑大小約為23～30nm的EV71、CA16 VLP，與完整的病毒顆粒結(jié)構(gòu)一致，通過蔗糖密度梯度離心純化，獲得了純度

5、在90％以上的EV71、CA16 VLP抗原；（2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較重組EV71、CA16 VLP單價(jià)、雙價(jià)疫苗的免疫原性。間接ELISA法顯示重組EV71、CA16單價(jià)、雙價(jià) VLP疫苗組與PBS對(duì)照組抗體水平差異顯著（p<0.05），且雙價(jià)組顯著高于單價(jià)組（p<0.05）。中和抗體效價(jià)測(cè)定顯示雙價(jià)組中和抗體效價(jià)高于單價(jià)組（p<0.05）。小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-4分泌細(xì)胞水平檢測(cè)顯示重組EV71、CA16 VLP疫苗各組均可以

6、檢測(cè)到一定水平的IFN-γ和相對(duì)較低水平的IL-4，且雙價(jià)疫苗組高于單價(jià)組。應(yīng)用 EV71-BJ、CA16-TS強(qiáng)毒株分別攻毒，證實(shí)重組EV71、CA16單價(jià)、雙價(jià)VLP疫苗均能有效保護(hù)5日齡ICR乳鼠抵抗致死劑量病毒的攻擊，且雙價(jià)VLP疫苗保護(hù)效果優(yōu)于單價(jià)VLP疫苗。
　　結(jié)論:通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建、表達(dá)和純化EV71、CA16 VLP，純度可達(dá)90%以上。研制的重組V71、CA16雙價(jià)VLP疫苗具有良好的免疫原性，