材料表面拓撲形貌的細胞響應(yīng)以及PLGA組織工程多孔支架的制備與軟骨組織修復(fù)研究.pdf

1、軟骨缺損修復(fù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有挑戰(zhàn)性的一個課題。組織工程學(xué)的出現(xiàn)，將可能使人們從傳統(tǒng)的器官移植和植入這種以傷補傷的方法進入到一個器官制造的新時代，其為軟骨缺損修復(fù)提供了新的思路和方法。軟骨組織的損傷或者缺損往往會伴隨軟骨下骨的改變，近年來，采用雙層支架來模擬關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨各自內(nèi)在結(jié)構(gòu)和生理功能以實現(xiàn)軟骨和軟骨下骨的同時修復(fù)成為一個新思路，但關(guān)于雙層支架的很多基本問題還有待于進一步探索。
　　未來生物材料的設(shè)計需要對于材料的細

2、胞響應(yīng)有深入的認識。近幾十年來的相關(guān)研究已經(jīng)大大加深了人們對于“生物材料”涵義的理解，同時也提供了更多探索的方向。材料的諸多因素可以影響細胞行為，其中，表面形貌的效應(yīng)普遍存在，并且由于形貌改變可不涉及化學(xué)成份的改變，故相應(yīng)的材料改性容易最終獲得批準應(yīng)用。
　　本博士論文以聚乳酸—羥基乙酸共聚物(PLGA)這種有應(yīng)用價值的可降解高分子為基質(zhì)材料，開展了生物醫(yī)用材料方面的研究。論文首先從二維平面探索微米拓撲形貌的細胞響應(yīng)行為并得出基本

3、規(guī)律，繼而將其應(yīng)用于三維多孔支架中，最后再用組織工程雙層支架進行關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨同時修復(fù)的動物實驗。該研究有助于理解材料物理因素對于細胞的作用，為生物材料設(shè)計提供指導(dǎo)。
　　本論文的主要創(chuàng)新性工作包括以下幾方面:
　　1.制備了一系列不同尺寸的微米陣列，研究其細胞響應(yīng)行為，并發(fā)現(xiàn)適合骨髓基質(zhì)干細胞黏附的尺寸。本論文在二維PLGA膜表面制備了一系列不同高度（深度）的微柱（微坑）陣列，然后研究骨髓基質(zhì)干細胞在這些拓撲形貌表面的

4、生長情況。根據(jù)實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)1μm高度（或深度）的微柱（或微坑）陣列相對于其它高度（或深度）的陣列更利于細胞的生長。進一步我們比較了1μm微坑和1μm微柱，發(fā)現(xiàn)1μm微柱比微坑和光滑膜更適合骨髓基質(zhì)干細胞的黏附。
　　2.利用材料表面微柱陣列實現(xiàn)了對于細胞核嚴重自我變形的調(diào)控。本論文工作過程中，意外發(fā)現(xiàn)新生大鼠骨髓基質(zhì)干細胞細胞核在特定高度的PLGA微柱陣列表面能發(fā)生嚴重自我變形;細胞核變形并非是由細胞核的重力作用引起的，而可

5、能是由細胞鋪展時的內(nèi)應(yīng)力導(dǎo)致;盡管骨髓基質(zhì)干細胞發(fā)生了如此嚴重的細胞核變形，其仍具備增殖和成骨分化的能力。本文通過設(shè)計不同微柱陣列，成功控制了細胞核的形狀，在國際上首次實現(xiàn)了啞鈴形、方形、十字交叉等異常細胞核形狀。此外進一步研究了另外五種細胞(Hela、PC12、NIH3T3、MC3T3、Chondrocyte)，發(fā)現(xiàn)細胞在微柱陣列表面的細胞核變形現(xiàn)象具有普適性;同時其響應(yīng)程度具有細胞類型依賴性。
　　3.通過設(shè)計新型致孔劑實現(xiàn)了

6、三維PLGA多孔支架內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)以及孔壁拓撲形貌的控制。基于粒子浸出技術(shù)，首次通過對石蠟球致孔劑表面物理修飾的辦法調(diào)控了組織工程支架內(nèi)表面微米拓撲形貌。在石蠟球這種致孔劑粒子表面通過氯化鈉粒子的撞擊制備出微米尺寸的凹坑，然后再把這些微米拓撲形貌轉(zhuǎn)移到三維多孔支架孔表面，從而獲得微米凸起結(jié)構(gòu)。三維多孔支架中的這些微米凸起能促進新生Sprague Dawley(SD)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的黏附，同時并不影響干細胞的增殖和分化。此外，還首次發(fā)明“

7、糖粘鹽”這種新型致孔劑，使得制備得到的組織工程支架具有規(guī)則的球形孔形狀以及良好的連通性，并且孔表面具有微米拓撲形貌。制備得到的組織工程多孔支架利于SD大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的生長。這些研究成果為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的材料設(shè)計提供新的視野和技術(shù)。
　　4.設(shè)計了PLGA雙層多孔支架，并通過合作研究，探討了支架物理參量對于體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果的影響。在動物實驗之前，本論文按照國家標準“醫(yī)療器械生物學(xué)評價”的相關(guān)要求設(shè)計了PLGA支架材料體

8、內(nèi)外的生物相容性實驗，并研究了其在新西蘭大白兔體內(nèi)的降解行為。通過實驗，發(fā)現(xiàn)PLGA支架材料細胞毒性小，血液相容性好，且不會在骨/軟骨缺損處引起明顯的炎癥反應(yīng)，同時具有合適的降解速率。另外，制備了雙層支架以修復(fù)新西蘭大白兔骨/軟骨缺損，并首次實現(xiàn)對雙層支架中各層最優(yōu)孔隙率、孔徑探索。設(shè)計并制備好雙層支架后，通過合作研究，將PLGA雙層支架植入新西蘭大白兔骨/軟骨缺損處(直徑4mm，深度5 mm)，以檢驗各組支架對其修復(fù)效果。術(shù)后12周，

9、從大體觀、H&E染色、甲苯胺藍染色、免疫組化染色、組織學(xué)評分和相關(guān)基因的表達這些結(jié)果中我們得出:軟骨段支架孔隙率為92％，骨段支架孔隙率為77％的雙層支架及軟骨段孔徑為100-200μm，骨段孔徑為300-450μm的雙層支架能實現(xiàn)比其它孔隙率或孔徑組合更好的修復(fù)效果。
　　除了上述工作以外，在“復(fù)旦大學(xué)博士生短期國際訪學(xué)資助計劃”資助下赴美國密歇根大學(xué)進行為期4個月短期交流期間，我還合成了兩組分的聚酸酐，并研究了其表面溶蝕性能、