材料表面拓?fù)湫蚊驳募?xì)胞響應(yīng)以及PLGA組織工程多孔支架的制備與軟骨組織修復(fù)研究.pdf

1、軟骨缺損修復(fù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有挑戰(zhàn)性的一個(gè)課題。組織工程學(xué)的出現(xiàn)，將可能使人們從傳統(tǒng)的器官移植和植入這種以傷補(bǔ)傷的方法進(jìn)入到一個(gè)器官制造的新時(shí)代，其為軟骨缺損修復(fù)提供了新的思路和方法。軟骨組織的損傷或者缺損往往會(huì)伴隨軟骨下骨的改變，近年來(lái)，采用雙層支架來(lái)模擬關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨各自內(nèi)在結(jié)構(gòu)和生理功能以實(shí)現(xiàn)軟骨和軟骨下骨的同時(shí)修復(fù)成為一個(gè)新思路，但關(guān)于雙層支架的很多基本問(wèn)題還有待于進(jìn)一步探索。
　　未來(lái)生物材料的設(shè)計(jì)需要對(duì)于材料的細(xì)

2、胞響應(yīng)有深入的認(rèn)識(shí)。近幾十年來(lái)的相關(guān)研究已經(jīng)大大加深了人們對(duì)于“生物材料”涵義的理解，同時(shí)也提供了更多探索的方向。材料的諸多因素可以影響細(xì)胞行為，其中，表面形貌的效應(yīng)普遍存在，并且由于形貌改變可不涉及化學(xué)成份的改變，故相應(yīng)的材料改性容易最終獲得批準(zhǔn)應(yīng)用。
　　本博士論文以聚乳酸—羥基乙酸共聚物(PLGA)這種有應(yīng)用價(jià)值的可降解高分子為基質(zhì)材料，開展了生物醫(yī)用材料方面的研究。論文首先從二維平面探索微米拓?fù)湫蚊驳募?xì)胞響應(yīng)行為并得出基本

3、規(guī)律，繼而將其應(yīng)用于三維多孔支架中，最后再用組織工程雙層支架進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨同時(shí)修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。該研究有助于理解材料物理因素對(duì)于細(xì)胞的作用，為生物材料設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。
　　本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新性工作包括以下幾方面:
　　1.制備了一系列不同尺寸的微米陣列，研究其細(xì)胞響應(yīng)行為，并發(fā)現(xiàn)適合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞黏附的尺寸。本論文在二維PLGA膜表面制備了一系列不同高度（深度）的微柱（微坑）陣列，然后研究骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在這些拓?fù)湫蚊脖砻娴?/p>

4、生長(zhǎng)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)1μm高度（或深度）的微柱（或微坑）陣列相對(duì)于其它高度（或深度）的陣列更利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步我們比較了1μm微坑和1μm微柱，發(fā)現(xiàn)1μm微柱比微坑和光滑膜更適合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的黏附。
　　2.利用材料表面微柱陣列實(shí)現(xiàn)了對(duì)于細(xì)胞核嚴(yán)重自我變形的調(diào)控。本論文工作過(guò)程中，意外發(fā)現(xiàn)新生大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核在特定高度的PLGA微柱陣列表面能發(fā)生嚴(yán)重自我變形;細(xì)胞核變形并非是由細(xì)胞核的重力作用引起的，而可

5、能是由細(xì)胞鋪展時(shí)的內(nèi)應(yīng)力導(dǎo)致;盡管骨髓基質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生了如此嚴(yán)重的細(xì)胞核變形，其仍具備增殖和成骨分化的能力。本文通過(guò)設(shè)計(jì)不同微柱陣列，成功控制了細(xì)胞核的形狀，在國(guó)際上首次實(shí)現(xiàn)了啞鈴形、方形、十字交叉等異常細(xì)胞核形狀。此外進(jìn)一步研究了另外五種細(xì)胞(Hela、PC12、NIH3T3、MC3T3、Chondrocyte)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在微柱陣列表面的細(xì)胞核變形現(xiàn)象具有普適性;同時(shí)其響應(yīng)程度具有細(xì)胞類型依賴性。
　　3.通過(guò)設(shè)計(jì)新型致孔劑實(shí)現(xiàn)了

6、三維PLGA多孔支架內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)以及孔壁拓?fù)湫蚊驳目刂??；诹Ｗ咏黾夹g(shù)，首次通過(guò)對(duì)石蠟球致孔劑表面物理修飾的辦法調(diào)控了組織工程支架內(nèi)表面微米拓?fù)湫蚊?。在石蠟球這種致孔劑粒子表面通過(guò)氯化鈉粒子的撞擊制備出微米尺寸的凹坑，然后再把這些微米拓?fù)湫蚊厕D(zhuǎn)移到三維多孔支架孔表面，從而獲得微米凸起結(jié)構(gòu)。三維多孔支架中的這些微米凸起能促進(jìn)新生Sprague Dawley(SD)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的黏附，同時(shí)并不影響干細(xì)胞的增殖和分化。此外，還首次發(fā)明“

7、糖粘鹽”這種新型致孔劑，使得制備得到的組織工程支架具有規(guī)則的球形孔形狀以及良好的連通性，并且孔表面具有微米拓?fù)湫蚊?。制備得到的組織工程多孔支架利于SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些研究成果為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的材料設(shè)計(jì)提供新的視野和技術(shù)。
　　4.設(shè)計(jì)了PLGA雙層多孔支架，并通過(guò)合作研究，探討了支架物理參量對(duì)于體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之前，本論文按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)”的相關(guān)要求設(shè)計(jì)了PLGA支架材料體

8、內(nèi)外的生物相容性實(shí)驗(yàn)，并研究了其在新西蘭大白兔體內(nèi)的降解行為。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PLGA支架材料細(xì)胞毒性小，血液相容性好，且不會(huì)在骨/軟骨缺損處引起明顯的炎癥反應(yīng)，同時(shí)具有合適的降解速率。另外，制備了雙層支架以修復(fù)新西蘭大白兔骨/軟骨缺損，并首次實(shí)現(xiàn)對(duì)雙層支架中各層最優(yōu)孔隙率、孔徑探索。設(shè)計(jì)并制備好雙層支架后，通過(guò)合作研究，將PLGA雙層支架植入新西蘭大白兔骨/軟骨缺損處(直徑4mm，深度5 mm)，以檢驗(yàn)各組支架對(duì)其修復(fù)效果。術(shù)后12周，

9、從大體觀、H&E染色、甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化染色、組織學(xué)評(píng)分和相關(guān)基因的表達(dá)這些結(jié)果中我們得出:軟骨段支架孔隙率為92％，骨段支架孔隙率為77％的雙層支架及軟骨段孔徑為100-200μm，骨段孔徑為300-450μm的雙層支架能實(shí)現(xiàn)比其它孔隙率或孔徑組合更好的修復(fù)效果。
　　除了上述工作以外，在“復(fù)旦大學(xué)博士生短期國(guó)際訪學(xué)資助計(jì)劃”資助下赴美國(guó)密歇根大學(xué)進(jìn)行為期4個(gè)月短期交流期間，我還合成了兩組分的聚酸酐，并研究了其表面溶蝕性能、