湖北地區(qū)漢族健康人群和器官移植患者中RAC1基因型-表型的分布及相關(guān)性研究.pdf

1、[目的]通過測(cè)定湖北地區(qū)漢族健康人群和器官移植患者群體（包括腎移植及非腎移植患者）RAC1基因內(nèi)含子區(qū)域rs836488 C/T、rs702482 T/A、rs10951982 G/A、rs702483 C/T、rs69549966 G/A以及3’UTR端rs9374 G/A等6個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）位點(diǎn)基因型、等位基因，RAC1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)水平和蛋白活性，探

2、索RAC1基因型及其轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)水平和蛋白活性在上述人群中的分布特征，并進(jìn)行基因型-表型的相關(guān)性研究。
　　[方法] RAC1基因多態(tài)性研究：采用病例-對(duì)照研究，選擇華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院和同濟(jì)醫(yī)院2012年8月至9月門診行免疫抑制藥血藥濃度監(jiān)測(cè)的器官移植患者602例（300例腎移植患者及302例非腎移植患者），及1000例同時(shí)期在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院參加健康體檢并合格的志愿者，采用實(shí)時(shí)熒光TaqM

3、an-MGB探針等位基因分型技術(shù)進(jìn)行RAC1基因上6個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型檢測(cè)，并采用分片段擴(kuò)增直接測(cè)序方法對(duì)上述6個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行抽樣驗(yàn)證。采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)等位基因、基因型在各試驗(yàn)組中的分布特征、差異。運(yùn)用Helpoview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析和標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Tag-SNP）的篩選。
　　RAC1基因Tag-SNPs位點(diǎn)基因型分析：選擇華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院和同濟(jì)醫(yī)院2014年2月至3月門診行

4、免疫抑制藥血藥濃度監(jiān)測(cè)的器官移植患者619例（314例腎移植患者及305例非腎移植患者），及同時(shí)期武漢協(xié)和醫(yī)院健康體檢志愿者1168例。采用實(shí)時(shí)熒光TaqMan-MGB探針等位基因分型技術(shù)進(jìn)行RAC1基因上Tag-SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)。采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)等位基因、基因型在各試驗(yàn)組中的分布特征、差異。運(yùn)用Helpoview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析。
　　RAC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量研究：按照各組間年齡和性別比匹配原則，以及

5、各SNPs位點(diǎn)的三種基因型數(shù)目匹配原則（如健康組rs10951982三種基因型的數(shù)目分別為GG-681、AG-53、AA-434，則GG、AG、AA基因型下各選擇50例人數(shù)），篩選出332例健康志愿者、164例腎移植患者和164例非腎移植患者（包括肝臟、心臟、骨髓移植）進(jìn)行RAC1mRNA和蛋白含量測(cè)定。采用Trizol法進(jìn)行mRNA提取，以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行RAC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定。Ct值代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值

6、所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)用2-ΔCt代表基因的相對(duì)表達(dá)量。每一樣品設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，ΔCt=目的基因平均Ct值–內(nèi)參基因平均Ct值。采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)RAC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在健康組、腎移植組和非腎移植組間的分布差異，并分析年齡、性別和基因型對(duì)RAC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。用t檢驗(yàn)分析兩組正態(tài)分布資料間的差異，單因素方差檢驗(yàn)分析三組正態(tài)分布資料間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、>　　Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白的定量研究：同RAC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量研究，本部分試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）提取測(cè)定了332例健康志愿者、164例腎移植患者和164例非腎移植患者（包括肝臟、心臟、骨髓移植）血漿中的Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平。每一樣品設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，測(cè)定每個(gè)樣本孔在450 nm波長(zhǎng)處的光吸收值（OD），用

8、平均值表示Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平。采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平在健康組、腎移植組和非腎移植組間的分布差異，并分析年齡、性別和基因型對(duì)Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平的影響。用 t檢驗(yàn)分析兩組正態(tài)分布資料間的差異，單因素方差檢驗(yàn)分析三組正態(tài)分布資料間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)果] RAC1基因多

9、態(tài)性研究結(jié)果：本研究入選的各組受試者年齡、性別分布相當(dāng)，具有可比性。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示 rs836488、rs702482、rs10951982、rs702483、rs69549966、rs9374各位點(diǎn)基因型的分布頻率符合遺傳平衡（P>0.05），說明本部分試驗(yàn)樣本的選取能夠代表中國(guó)湖北地區(qū)人群基因多態(tài)性的特點(diǎn)。本研究選擇的6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型和等位基因在健康組、腎移植組和非腎移植組三組間的分布趨勢(shì)相

10、同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。且本研究中的所有位點(diǎn)的最小等位基因頻率（Minimum allele frequency，MAF）與數(shù)據(jù)庫(kù)中北京漢族人群的MAF相似，也與已有文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)人群的MAF接近。運(yùn)用Helpoview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析顯示rs836488與rs702482（r2=0.955），rs10951982與rs9374（r2=0.908）為高度連鎖不平衡，rs702483、rs6954996與其它位點(diǎn)之間相

11、互獨(dú)立。因此從rs836488、rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996、rs9374這6個(gè)SNPs位點(diǎn)中篩選出了人4個(gè)Tag-SNPs位點(diǎn)： rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996。
　　RAC1基因Tag-SNPs位點(diǎn)基因型分析：本研究入選的各組受試者年齡、性別分布相當(dāng)，具有可比性。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示Tag-SNPs各基因型

12、的分布頻率符合遺傳平衡（P>0.05），說明本部分樣本的選取能夠代表中國(guó)湖北地區(qū)人群基因型分布特點(diǎn)。這4個(gè)Tag-SNPs的基因型、等位基因在健康組、腎移植組和非腎移植組三組間的分布趨勢(shì)相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。將健康組、腎移植組、非腎移植組進(jìn)行兩兩比較，應(yīng)用非條件Logistic回歸分析計(jì)算基因型間和等位基因間相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比OR及其95％可信區(qū)間，各組間比較所得P值均大于0.05，暗示rs702482、rs10951

13、982、rs702483、rs6954996多態(tài)性分布與試驗(yàn)分組無關(guān)聯(lián)，所選定的4個(gè)Tag-SNPs位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與相關(guān)器官實(shí)質(zhì)性病變或慢性腎功能衰竭導(dǎo)致尿毒癥（腎移植術(shù)主要適應(yīng)證）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。
　　RAC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量研究結(jié)果：本研究入選的各組受試者年齡、性別分布相當(dāng)，具有可比性。代表RAC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量的2-ΔCt值為非正態(tài)分布，將原始結(jié)果進(jìn)行取對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后 Log2-ΔC滿足正態(tài)分布。本研究結(jié)果表明

14、：RAC1基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量在健康組、腎移植組和非腎移植組三組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），推測(cè)RAC1 mRNA表達(dá)量可能與相關(guān)器官實(shí)質(zhì)性病變或慢性腎功能衰竭導(dǎo)致尿毒癥（腎移植術(shù)主要適應(yīng)證）發(fā)病無關(guān)。RAC1 mRNA表達(dá)量與性別和年齡無關(guān)（P>0.05）?；蛐?mRNA相關(guān)性研究顯示：健康人群rs6954996-AA基因型攜帶者RAC1 mRNA表達(dá)水平比另兩種基因型AG、GG攜帶者的RAC1 mRNA表達(dá)水平低，其

15、中AA與GG之間的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；非腎移植人群rs10951982-AA基因型攜帶者的RAC1 mRNA表達(dá)水平比另兩種基因型AG、GG攜帶者的RAC1 mRNA表達(dá)水平高，其中AA與GG之間的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；健康人群rs702482-TT基因型攜帶者的RAC1mRNA表達(dá)水平顯著低于另兩種基因型AT、AA攜帶者的RAC1mRNA表達(dá)水平（P<0.05）；但是非腎移植人

16、群 rs702482-TT基因型攜帶者的RAC1 mRNA表達(dá)水平顯著高于另兩種基因型AT、AA攜帶者的RAC1mRNA表達(dá)水平（P<0.05）。本研究推測(cè)在健康人群中，rs702482-TT和rs6954996-AA可能為導(dǎo)致RAC1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)下調(diào)的基因型；而在非腎移植人群中，rs10951982-AA和rs702482-TT中可能為導(dǎo)致RAC1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)上調(diào)的基因型。
　　Rac1總蛋白的定量研究結(jié)果：

17、本研究入選的各組受試者年齡、性別分布相當(dāng)，具有可比性。由于結(jié)果為非正態(tài)分布，將原始結(jié)果進(jìn)行取對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后滿足正態(tài)分布。本研究得出健康組的Rac1總蛋白含量水平顯著高于腎移植組和非腎移植組（P<0.05），而腎移植組和非腎移植組間總Rac1蛋白含量水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。女性的Rac1總蛋白含量水平普遍高于男性，特別是在腎移植組和非腎移植組兩組中，這種性別間的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Rac1總蛋白含量水平與年齡

18、無顯著相關(guān)性（P>0.05，R2<0.1）。腎移植人群rs702482-AA基因型攜帶者的Rac1總蛋白含量水平顯著低于基因型rs702482-AT攜帶者的Rac1總蛋白含量水平（P<0.05）；非腎移植人群 rs702483-AA基因型攜帶者的Rac1總蛋白含量水平顯著低于基因型rs702483-AG攜帶者的Rac1總蛋白含量水平低（P<0.05）。其它基因型則未觀察到與Rac1總蛋白含量水平有相關(guān)性（P>0.05）。
　　Ra

19、c1-GTP活性蛋白的定量研究結(jié)果：本研究入選的各組受試者年齡、性別分布相當(dāng)，具有可比性。由于結(jié)果為非正態(tài)分布，將原始結(jié)果進(jìn)行取對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后滿足正態(tài)分布。本研究得出健康組的Rac1-GTP活性蛋白含量水平顯著高于腎移植組和非腎移植組（P<0.05），而腎移植組和非腎移植組間總Rac1-GTP活性蛋白含量水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。女性的Rac1-GTP活性蛋白含量水平普遍高于男性，特別是在健康組和腎移植組兩組中，這種性別間的差異

20、有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Rac1-GTP活性蛋白含量水平與年齡無顯著相關(guān)性（P>0.05，R2<0.1）。健康組
　　rs10951982-AA基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平顯著低于另兩種基因型AG、GG攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；健康組rs702482-AT基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平顯著高于另兩種基因型AA、TT攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平

21、（P<0.05）；非腎移植組rs10951982-AA基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平顯著低于rs10951982-AG基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；非腎移植組rs702483-AA基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平顯著低于rs702483-AG基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；其它基因型則沒有觀察到與Rac1-GTP活性蛋白含量水平有相關(guān)性（P>

22、0.05）。
　　[結(jié)論]本研究首次在中國(guó)湖北地區(qū)健康人群和器官移植人群中進(jìn)行了RAC1基因型，及其轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)水平和蛋白活性研究。本研究測(cè)定分析了RAC1基因上6個(gè)SNPs位點(diǎn)、RAC1 mRNA、Rac1總蛋白以及Rac1-GTP活性蛋白在上述人群中的分布特征，并進(jìn)行了基因型-表型的相關(guān)性研究。根據(jù)研究結(jié)果可以得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：
　　1）RAC1基因上6個(gè)SNPs位點(diǎn)rs836488、rs702482、rs1095

23、1982、rs702483、rs6954996、rs9374的等位基因和基因型在健康組、腎移植組和非腎移植組中的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。此研究為湖北漢族人群RAC1基因多態(tài)性提供了相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步擴(kuò)大了中國(guó)不同地區(qū)人群中RAC1基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)資料。
　　2）RAC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在健康人群、腎移植人群和非腎移植人群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），推測(cè)RAC1 mRNA表達(dá)量可能與相關(guān)器官實(shí)質(zhì)性病變或慢性腎功能

24、衰竭導(dǎo)致尿毒癥（腎移植術(shù)主要適應(yīng)證）發(fā)病無關(guān)。健康人群的Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平都顯著高于腎移植人群和非腎移植人群（P<0.05），而器官移植人群間Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平?jīng)]有顯著性差異（P>0.05），考慮為器官移植人群的用藥抑制了Rac1蛋白的活性。
　　3）RAC1 mRNA表達(dá)量與性別無相關(guān)性（P>0.05）。而女性的Rac1總蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平普遍高于男

25、性（P<0.05）。
　　4）RAC1 mRNA、Rac1蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平與年齡無顯著相關(guān)性（P>0.05，R2<0.1）。
　　5）基因型-表型相關(guān)性研究：部分基因型與RAC1mRNA、蛋白表達(dá)量相關(guān)（P<0.05），而mRNA與蛋白水平之間沒有相關(guān)性（P>0.05）。對(duì)于rs702482，健康組TT基因型攜帶者的RAC1 mRNA表達(dá)量比其它基因型攜帶者低，但是非腎移植組TT基因型攜帶者的RAC1

26、mRNA表達(dá)量比其它基因型攜帶者高；腎移植組AA基因型攜帶者的Rac1總蛋白含量水平比其它基因型攜帶者低；健康組 AT基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平比其它基因型攜帶者高。對(duì)于rs10951982，健康組和非腎移植組AA基因型攜帶者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平比其它基因型攜帶者低；但是非腎移植組AA基因型攜帶者的RAC1 mRNA表達(dá)量比其它基因型攜帶者高。對(duì)于rs702483，非腎移植組AA基因型攜帶者的Rac1總