牡丹紅斑病及牡丹黑斑病病原鑒定.pdf

1、牡丹紅斑病和牡丹黑斑病均為牡丹種植區(qū)危害最嚴重的病害，它們不僅危害牡丹的葉片，還對花、種子、莖等造成嚴重危害，使牡丹葉片產(chǎn)生病斑、穿孔，嚴重者甚至引起整個植株死亡，嚴重影響牡丹生長發(fā)育，降低了牡丹的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益。目前，國內(nèi)外對牡丹病害研究較少，對牡丹紅斑病的鑒定一直停留在形態(tài)學鑒定的水平上，而對牡丹黑斑病的研究只有簡單的病征記錄和防治研究，對致病菌只是模糊地描述為鏈格孢屬（Alternaria）真菌，尚無明確結論。本研究結合傳統(tǒng)

2、的形態(tài)學鑒定和致病性鑒定，在分子水平上對牡丹紅斑病和黑斑病病原菌進行鑒定，以期明確上述兩種病害的確切病原菌，提供快速、準確的鑒定方法，為病害快速診斷和防治措施提供技術支持。
　　1.形態(tài)學鑒定牡丹病斑病原菌為牡丹枝孢霉
　　從山東農(nóng)業(yè)大學牡丹種質(zhì)資源圃采集不同品種的牡丹、芍藥紅斑病的發(fā)病葉片樣品，利用組織分離法對病原菌進行分離，在PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)得到病原菌純菌落，保存利用。在顯微鏡下對病原菌的菌絲體和分生孢子進行拍照觀

3、察，將從22個不同品種寄主上得到的菌株的分生孢子隨機取50個樣測量其分生孢子長和寬，計算平均值，得其長在9.4μm-9.8μm之間，孢子寬在4.5μm-4.9μm之間,結果表明不同寄主間沒有明顯差異，且與魏景超對牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）的描述相一致。
　　2.分子鑒定牡丹紅斑病病原菌為牡丹枝孢霉
　　利用CTAB法對不同寄主上得到的分離物進行DNA提取，進行PCR擴增后，送由專業(yè)公司對菌株的I

4、TS區(qū)域進行測序，將測序結果在Genbank中進行BLAST對比分析，發(fā)現(xiàn)其與已經(jīng)提交的牡丹枝孢霉Genbank中登錄的序列號為GQ395812的ITS序列相似性系數(shù)為99％以上。將從牡丹品種‘丁香紫’、‘趙粉’和芍藥品種‘大葉粉’、‘桃李艷’上分離獲得的菌株的ITS核苷酸序列，在Genbank中注冊獲得的登錄號為KJ638030、KJ682319、KJ682320、KJ682321。利用Mega5軟件將4個菌株的ITS區(qū)序列和Genb

5、ank中下載的已知登錄號的Cladosporium屬的24個菌株進行BLAST序列分析，構建聚類分析樹狀圖，可將枝孢霉屬分為4個聚類組，4個樣品菌株KJ638030、KJ682319、KJ682320、KJ682321與牡丹枝孢霉的同源性最高，達到99％以上，聚為一組。結合形態(tài)學鑒定、致病性鑒定可以鑒定該病的致病菌為牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）。四個菌株分別從不同寄主品種上分離獲得，說明泰安地區(qū)牡丹枝孢霉沒有

6、遺傳差異，且不同種、品種的寄主對菌株的遺傳特性不造成影響。
　　3.牡丹紅斑病病原菌致病性鑒定
　　采用菌絲塊針刺接種和菌絲塊無傷口接種兩種方法，在實驗室將分離物接種到牡丹葉片上，寄主牡丹品種為‘綠繡球’、‘豆綠’、‘紅珠女’、‘玉版白’、‘黑海撒金五個品種。觀察發(fā)現(xiàn)，采用同種接種方法接種的5個品種的牡丹葉片的發(fā)病率和感病特征沒有差異。將接種后發(fā)病病斑重新進行組織分離，得到的病原菌與接種菌一致，證明該菌為牡丹紅斑病的致病菌。

7、同時，兩種接種方法比對可發(fā)現(xiàn)，刺傷接種的葉片發(fā)病早，無傷接種的葉片發(fā)病晚，且擴展速度明顯比刺傷接種的葉片慢，但對照組的牡丹品種均不出現(xiàn)感病癥狀。說明在室內(nèi)接種條件下，牡丹紅斑病病原菌的致病性與寄主品種無關，傷口的存在有利于病原菌的侵入可加快侵染速度，但是在自然無傷的條件下，病原菌也可對寄主進行侵害。
　　4.鑒定牡丹黑斑病病原菌為Alternaria alternata
　　通過對泰安地區(qū)的牡丹病葉進行組織分離，利用形態(tài)學方

8、法結合分子生物學技術對病原菌進行鑒定，并利用Mega5軟件對鏈格孢屬的22個種進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，進一步明確其分類地位。結果表明:該病致病菌的ITS序列與GenBank中登錄的A.alternata、A.tenuissima、A.metachromatica相似性均為100％，利用DNAMAN軟件對核苷酸一致性進行比較，發(fā)現(xiàn)樣品菌株與A.alternata相似性最高，結合形態(tài)學方法鑒定該病致病菌為Alternaria alternata