禽腺聯(lián)病毒序列促進(jìn)人組織激肽釋放酶在雞輸卵管的表達(dá)、鑒定及檢測(cè)方法建立.pdf

1、腺聯(lián)病毒(adeno-associated virus，AAV)是很有前景的基因治療載體。禽腺聯(lián)病毒(avian adeno-associated virus，AAAV)具有與人AAV類似的潛伏感染特性和基因組結(jié)構(gòu)。為了探索AAAV末端反向重復(fù)(ITR)和Rep基因序列能否促進(jìn)外源基因的整合和表達(dá)，本研究將人組織激肽釋放酶(hKLKl)雞輸卵管特異表達(dá)盒克隆在AAAV ITR之間，并將CMV啟動(dòng)子控制的Rep基因表達(dá)盒構(gòu)建于同一載體，獲

2、得重組表達(dá)載體pRep2ITR-OV4-KLKl。以不含AAAV序列的雞輸卵管表達(dá)載體pOV4-KLKl為對(duì)照，通過(guò)體外釋放實(shí)驗(yàn)確定PEI與質(zhì)粒DNA的包被條件為N/P=5；用生理鹽水稀釋PEI-質(zhì)粒DNA復(fù)合物，經(jīng)翅靜脈注射產(chǎn)蛋雞。蛋清中重組酶的活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在質(zhì)粒DNA相同的條件下，pRep21TR-OV4-KLKl表達(dá)hK1的水平及維持時(shí)間較pOV4K有所提高或延長(zhǎng)，但不能維持持久表達(dá)。這些試驗(yàn)結(jié)果提示，AAAV ITR和(或

3、)Rep序列能促進(jìn)hKLKl在雞輸卵管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，但不能介導(dǎo)外源基因的整合或整合效率很低。 為了進(jìn)一步研究rhKl的理化特性，對(duì)載體注射雞蛋清進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示rhK l能被hKl特異抗體識(shí)別，成熟酶的分子量為37 kDa；將雞蛋清用不同pH的緩沖液稀釋，然后進(jìn)行酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示rhKl在pH7-10范圍內(nèi)均有較強(qiáng)活性；將雞蛋清用含不同金屬離子(終濃度為0.01M)的緩沖液稀釋，然后進(jìn)行

4、酶活性測(cè)定，結(jié)果表明rhKl能被Cuz+、Fe3+和Al3+完全抑制；將雞蛋清用緩沖液適當(dāng)稀釋，在不同溫度下孵育一定時(shí)間，然后進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果顯示37℃孵育20min能顯著激活酶活性，而100℃孵育30min能使酶失活。 為了建立hKl的定量檢測(cè)方法，以飽和硫酸銨．葡萄球菌A蛋白純化的hKl特異單克隆抗體為包被抗體，以親和層析純化的GST-hKl融合蛋白為抗原，建立雙抗體夾心ELISA方法。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，檢測(cè)已知抗原的