OsCDPK12的啟動(dòng)子分析及水稻CDPKs與GRXs的蛋白互作研究.pdf

1、CDPKs(calcium-dependent and calmodulin-independent protein kinases)，全稱(chēng)依賴(lài)鈣而不依賴(lài)鈣調(diào)素的蛋白激酶，是一類(lèi)僅在植物和部分原生生物中存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)和逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。目前在水稻中已發(fā)現(xiàn)31個(gè)CDPKs基因，但功能明確的只有少數(shù)幾個(gè)基因，其它大多數(shù)基因的功能有待進(jìn)一步研究。本項(xiàng)研究是針對(duì)OsCDPK12和OsCDPK24兩

2、個(gè)基因開(kāi)展的。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臤sCDPK12的啟動(dòng)子分析：通過(guò)PCR技術(shù)從日本晴(Oryza sativaL ssp.Japonica)基因組上克隆到OsCDPK12上游2109 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，命名為12P，將其融合報(bào)告基因β-glucuronidas(G US)，轉(zhuǎn)化水稻中花11(Oryza sativaL ssp.Japonica)，組織化學(xué)染色結(jié)果顯示主要在根莖過(guò)渡區(qū)、莖節(jié)、花藥、種子中表達(dá);之后對(duì)該啟動(dòng)子

3、進(jìn)行5'端缺失分析，構(gòu)建8個(gè)融合報(bào)告基因GUS的缺失載體，對(duì)其轉(zhuǎn)基因水稻植株的研究發(fā)現(xiàn)，除12P687外，各個(gè)缺失啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)GUS基因在根莖過(guò)渡區(qū)、幼穗花藥、枝梗、莖節(jié)、種子中表達(dá)，而在葉、葉鞘和根中不表達(dá)，12P687卻能驅(qū)動(dòng)GUS基因在各個(gè)組織中表達(dá)，表現(xiàn)為組成型表達(dá)的特征；對(duì)比分析不同缺失啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株各組織的染色結(jié)果，可以看出，在-966 bp～-687 bp區(qū)域，存在關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控元件;-687bp～-472 bp區(qū)域，具

4、有正向調(diào)控的順式作用元件；GUS活性的定量測(cè)定結(jié)果顯示，12P687啟動(dòng)子在葉和葉鞘組織中的活性約為35S啟動(dòng)子活性的1/2，而根中12P687啟動(dòng)子的活性約為35S啟動(dòng)子活性的1/3；對(duì)不同缺失啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了低溫、低氮和高鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)12P1828的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)冷脅迫后在葉片中表達(dá)上升，而12P687的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)高鹽脅迫后在根中表達(dá)下降。
　?、扑綜DPKs與GRXs的蛋白互作研究：克隆了水稻GRXs的22個(gè)基

5、因，分別是:OsGRX3、OsGRX4、OsGRX5、OsGRX6、OsGRX8、 OsGRX、OsGRX11、OsGRX12、OsGRX14、OsGRX15、OsGRX16、OsGRX17、OsGRX19、 OsGRX20、OsGRX21、OsGRX22、OsGRX24、OsGRX25、OsGRX26、OsGRX27、OsGRX28、OsGRX29。并將其分別構(gòu)建到AD載體上，獲得22個(gè)重組載體。通過(guò)自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均無(wú)潛在激活基因轉(zhuǎn)

6、錄活性；OsCDPK24與水稻GRXs的蛋白互作驗(yàn)證結(jié)果表明OsGRX8、OsGRX16、OsGRX26、OsGRX28分別與OsCDPK24-1的蛋白是有互作的，而OsGRX8、OsGRX14、OsGRX16、OsGRX26、OsGRX28分別與OsCDPK24-2的蛋白也是互作的；分別克隆水稻CDPKs序列OsCDPK2、OsCDPK20、OsCDPK21、OsCDPK23、OsCDPK25、OsCDPK29全長(zhǎng)序列及截短序列。并將

7、其分別構(gòu)建到BD載體上獲得重組載體。通過(guò)自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除OsCDPK23-1外均無(wú)潛在激活基因轉(zhuǎn)錄活性；水稻CDPKs與GRXs的蛋白互作驗(yàn)證結(jié)果表明OsCDPK4、OsCDPK12、OsCDPK20、OsCDPK21、OsCDPK25、OsCDPK29與水稻GRXs蛋白均無(wú)互作；通過(guò)DNAMAN工具對(duì)OsGRX8、OsGRX14、OsGRX16、OsGRX26、OsGRX28的氨基酸序列進(jìn)行了多重序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些序列并沒(méi)有明顯