OsCDPK12的啟動子分析及水稻CDPKs與GRXs的蛋白互作研究.pdf

1、CDPKs(calcium-dependent and calmodulin-independent protein kinases)，全稱依賴鈣而不依賴鈣調(diào)素的蛋白激酶，是一類僅在植物和部分原生生物中存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在介導植物生長發(fā)育信號和逆境信號轉(zhuǎn)導中具有重要作用。目前在水稻中已發(fā)現(xiàn)31個CDPKs基因，但功能明確的只有少數(shù)幾個基因，其它大多數(shù)基因的功能有待進一步研究。本項研究是針對OsCDPK12和OsCDPK24兩

2、個基因開展的。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴OsCDPK12的啟動子分析：通過PCR技術(shù)從日本晴(Oryza sativaL ssp.Japonica)基因組上克隆到OsCDPK12上游2109 bp的啟動子區(qū)域，命名為12P，將其融合報告基因β-glucuronidas(G US)，轉(zhuǎn)化水稻中花11(Oryza sativaL ssp.Japonica)，組織化學染色結(jié)果顯示主要在根莖過渡區(qū)、莖節(jié)、花藥、種子中表達;之后對該啟動子

3、進行5'端缺失分析，構(gòu)建8個融合報告基因GUS的缺失載體，對其轉(zhuǎn)基因水稻植株的研究發(fā)現(xiàn)，除12P687外，各個缺失啟動子均能驅(qū)動GUS基因在根莖過渡區(qū)、幼穗花藥、枝梗、莖節(jié)、種子中表達，而在葉、葉鞘和根中不表達，12P687卻能驅(qū)動GUS基因在各個組織中表達，表現(xiàn)為組成型表達的特征；對比分析不同缺失啟動子轉(zhuǎn)基因植株各組織的染色結(jié)果，可以看出，在-966 bp～-687 bp區(qū)域，存在關(guān)鍵的負調(diào)控元件;-687bp～-472 bp區(qū)域，具

4、有正向調(diào)控的順式作用元件；GUS活性的定量測定結(jié)果顯示，12P687啟動子在葉和葉鞘組織中的活性約為35S啟動子活性的1/2，而根中12P687啟動子的活性約為35S啟動子活性的1/3；對不同缺失啟動子的轉(zhuǎn)基因植株進行了低溫、低氮和高鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)12P1828的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)冷脅迫后在葉片中表達上升，而12P687的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)高鹽脅迫后在根中表達下降。
　　⑵水稻CDPKs與GRXs的蛋白互作研究：克隆了水稻GRXs的22個基

5、因，分別是:OsGRX3、OsGRX4、OsGRX5、OsGRX6、OsGRX8、 OsGRX、OsGRX11、OsGRX12、OsGRX14、OsGRX15、OsGRX16、OsGRX17、OsGRX19、 OsGRX20、OsGRX21、OsGRX22、OsGRX24、OsGRX25、OsGRX26、OsGRX27、OsGRX28、OsGRX29。并將其分別構(gòu)建到AD載體上，獲得22個重組載體。通過自激活檢測，發(fā)現(xiàn)均無潛在激活基因轉(zhuǎn)

6、錄活性；OsCDPK24與水稻GRXs的蛋白互作驗證結(jié)果表明OsGRX8、OsGRX16、OsGRX26、OsGRX28分別與OsCDPK24-1的蛋白是有互作的，而OsGRX8、OsGRX14、OsGRX16、OsGRX26、OsGRX28分別與OsCDPK24-2的蛋白也是互作的；分別克隆水稻CDPKs序列OsCDPK2、OsCDPK20、OsCDPK21、OsCDPK23、OsCDPK25、OsCDPK29全長序列及截短序列。并將

7、其分別構(gòu)建到BD載體上獲得重組載體。通過自激活檢測，發(fā)現(xiàn)除OsCDPK23-1外均無潛在激活基因轉(zhuǎn)錄活性；水稻CDPKs與GRXs的蛋白互作驗證結(jié)果表明OsCDPK4、OsCDPK12、OsCDPK20、OsCDPK21、OsCDPK25、OsCDPK29與水稻GRXs蛋白均無互作；通過DNAMAN工具對OsGRX8、OsGRX14、OsGRX16、OsGRX26、OsGRX28的氨基酸序列進行了多重序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些序列并沒有明顯