水稻組織特異型合成啟動子的構(gòu)建、雙向啟動子的鑒定及OsPGIP1在抗紋枯病中的功能研究.pdf

1、植物生長發(fā)育、形態(tài)建成以及環(huán)境適應(yīng)與基因在特定時期、空間和信號刺激下的特異表達息息相關(guān)，而基因表達模式的多樣性取決于從轉(zhuǎn)錄到翻譯各級不同水平的調(diào)控。在整個基因表達調(diào)控系統(tǒng)中，啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上的重要調(diào)控元件，是基因表達的“開路者”。啟動子能夠有效調(diào)控下游基因表達的起始、關(guān)閉以及豐度，同時在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理的研究中也扮演著重要的角色。因此，對啟動子的深入研究具有巨大的應(yīng)用潛力和理論價值。
　　水稻是世界上最重要的糧食作物之一，亦是禾本

2、科作物功能基因組學(xué)研究的模式植物。完備的基因組信息及較為清楚的基因表達信息為組織特異表達合成啟動子、順式調(diào)控元件以及雙向啟動子的研究提供了極大的便利。
　　紋枯病對水稻的生長、發(fā)育和生產(chǎn)造成大面積的嚴重危害。由于現(xiàn)有水稻種質(zhì)資源中沒有對紋枯病具有完全抗性的品種，抗紋枯病的主效QTL也沒有得到鑒定，同時抗紋枯病轉(zhuǎn)基因育種受到候選基因的巨大限制，因此水稻抗紋枯病育種長時間以來都沒有取得巨大突破。近年來，大量研究表明多聚半乳糖醛酸酶抑制

3、蛋白(PGIP)可以阻止病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)對植物細胞壁的降解，從而提升植物對病原菌的抗性。
　　本研究的工作內(nèi)容和獲得的成果主要分為三個部分:一、水稻新型組織特異表達合成啟動子的構(gòu)建及順式調(diào)控元件的篩選和功能分析;二、水稻內(nèi)源雙向啟動子的分離鑒定和功能分析;三、OsPGIP1基因在水稻抗紋枯病中的功能研究。
　　1.本研究首先將七個功能清晰的水稻組織特異表達相關(guān)調(diào)控序列以不同方式進行融合，最終獲得了五個新的

4、綠色組織特異表達的合成啟動子，分別是:GSSP1、GSSP3、GSSP5、GSSP6和GSSP7。隨后，在水稻全基因組水平上對不同組織特異表達基因的啟動子區(qū)域進行順式元件掃描及統(tǒng)計，得到10個在綠色組織特異表達基因的啟動子區(qū)域中高頻出現(xiàn)的順式元件。結(jié)合生物信息學(xué)分析及試驗驗證，最終分離克隆了一個可用于合成水稻綠色組織特異表達啟動子的通用序列5'-AAAATATTTAT-3'（下劃線序列表示核心元件，本研究中命名為GEAT），并對GEAT

5、的側(cè)翼序列進行了詳細的功能分析。該研究結(jié)果為組織特異表達合成啟動子的研究、全基因組水平組織特異表達順式調(diào)控元件的篩選、鑒定及其側(cè)翼序列功能分析提供了一個可借鑒的方法。
　　2.本研究結(jié)合MSU和RAP數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫中的表達譜芯片數(shù)據(jù)在水稻基因組中選取了四個候選雙向啟動子，分別命名為:BIP1，BIP2，BIP3和BIP4。通過轉(zhuǎn)基因水稻中的功能鑒定證實它們均具有雙向表達活性。然后對其中一個雙向啟動子

6、BIP1進行5'和3'缺失分析，鑒定出其雙向表達調(diào)控區(qū)段以及控制其5'和3'方向基本表達活性的區(qū)段。隨后，利用生物信息學(xué)手段分析了這四個雙向啟動子的保守性，并鑒定出可能與雙向表達相關(guān)的兩個新的順式序列。本研究建立了一個雙向啟動子的篩選、克隆、功能分析以及尋找雙向表達調(diào)控區(qū)段和雙向表達相關(guān)的順式序列的完整方法。
　　3.本研究將OsPGIP1基因在大腸桿菌中進行原核表達，純化出OsPGIP1蛋白。水稻紋枯病菌PG酶的活性抑制試驗證明

7、OsPGIP1對紋枯病菌PG酶具有明顯的抑制活性。另外，我們通過水稻原生質(zhì)體和洋蔥表皮細胞的亞細胞定位試驗進一步確定其發(fā)揮功能的位置。在獲得超表達OsPGIP1基因單拷貝純合株系后，我們利用Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)基因純合植株中OsPGIP1的表達量。田間紋枯病菌接種試驗顯示轉(zhuǎn)基因植株對紋枯病的抗病性有明顯提高，并且抗性提高水平與OsPGIP1的表達量水平一致。本研究結(jié)果不僅闡述了OsPGIP1基因的功能及其可能的作用機制，也為