水稻化學誘導基因及其啟動子序列的分離和分析.pdf

1、化學誘導表達系統(tǒng)是植物基因控制表達的重要工具，在實驗室和大田具有很大的應用潛力，此類系統(tǒng)的實用性依賴于誘導的特異性和可調控性，以及使用成本和環(huán)境相容性。本研究用一種殺菌劑(丙環(huán)唑)和兩種除草劑安全劑(AD67、二氯乙酰胺)對水稻品種931I的幼苗進行了誘導處理，采用差異顯示技術分離回收了誘導表達的基因片段，鑒定了10個陽性表達片段，對誘導基因的功能及轉錄元件進行了分析，構建了啟動子功能分析載體。主要結果如下： 1．差異表達基因片

2、段的獲得。采用3種誘導劑對3葉期水稻幼苗進行誘導處理，處理時間分別為Oh(CK)、6h、12h、24h、48h、3d、4d、5d。通過對各處理總RNA的分離和差異顯示分析，獲得了67個差異表達片段。 2．差異表達基因片段陽性驗證。根據(jù)不同的引物組合，對差異片段進行了重擴增、電泳分離、轉膜和雜交，從中篩選得到經(jīng)反式Northern Blotting驗證的10個陽性表達片段。 3．對陽性片段的序列分析。采用PMDl8-T載體

3、對陽性片段進行克隆并測序。序列提交GeneBank進行同源序列搜索，獲取基因功能的相關注釋。結果表明，Y2和Y11是未知序列；其他8個片段中Y1和Y7是未知功能的基因，Y3為二磷酸鳥苷一甘露糖一焦磷酸化酶基因(GDP-mannose pyrophosphorylase，GMP)，Y5為核糖體蛋白F因子蛋白(SM-F)，Y6為葉綠體1，5二磷酸核酮糖羧化酶(RBCL)基因，Y8為YIPPEE基因，Y9為Vps55蛋白，V10為富含甘氨酸的

4、RNA結合蛋白GRP/A。 4．對誘導基因的5'端啟動子區(qū)域進行了轉錄元件分析。因Y2和Y11無法進行物理定位未做分析。在其他8個基因的5'端上游搜索到多種轉錄元件，其中除了TATA框等核心啟動子序列外，還有多個CAAT增強子調節(jié)元件。比較還發(fā)現(xiàn)，誘導基因的上游普遍含有一些植物逆境應答元件，出現(xiàn)頻率較高的有ABA應答元件ABRE，光應答元件ACE、BOX4、SPI和GATA，還有干旱應答元件MBS和茉莉酸甲脂的應答元件GGTCA

5、、TGACG-motif、CGTCA-motif等。另外，還發(fā)現(xiàn)參與抗病和逆境脅迫應答轉錄元件(TC-rich repeats)，以及水楊酸應答的TCA元件。 5．對GMPase和YIPPEE基因進行了表達分析。RT-PCR和NORTHERN分析表明，兩個基因的表達都在誘導劑處理6小時開始出現(xiàn)上升，GMPase基因在處理2d時達到高峰，YIPPEE基因在誘導處理12h時達到高峰，兩基因在5天內持續(xù)表達。 6．構建了YIP