胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ對(duì)其受體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ對(duì)其受體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王俊宏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：潘世揚(yáng)章明慶20030418南京醫(yī)科火學(xué)碩士學(xué)位論文酶消化細(xì)胞，用完全1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄去培養(yǎng)液，改用無(wú)血清的1640培養(yǎng)液(不全1640培養(yǎng)液)培養(yǎng)12h后，每孔加入一定量的rlGF—I至終濃度為20n∥ml，按0、2、4、8、16h不

2、同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。淋巴細(xì)胞采用RPMI16404％人“AB”血清直接培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，改用不全1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h后同樣加入rlGFI至每孔中終濃度為20ng／ml，按上述相同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)不加rIGFI的空白對(duì)照，在相同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。細(xì)胞收集后用Tripure提取RNA，以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)恒定的天冬氨酰合成酶基因(AS)作為內(nèi)參照，采用一步法RTRCR試劑盒同時(shí)擴(kuò)增AS和IGFIR基因。擴(kuò)增

3、產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳，攝像后采用Kodak凝膠圖象分析軟件分析兩者表達(dá)強(qiáng)度，利用公式積分光密度(IOD)1GF。R／IODAs對(duì)IGFIRmRNA進(jìn)行相對(duì)定量。，實(shí)驗(yàn)第二部分按第一部分相同的方法培養(yǎng)淋巴細(xì)胞和A5459細(xì)胞，按終濃度為0、5、20、80、160、320ng／ml各孔加入相應(yīng)的rlGFI，并根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳作用時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行RTPCR基因擴(kuò)增定量分析觀察不同濃度rIGFI作用對(duì)淋巴細(xì)胞和

4、A549細(xì)胞各自IGFIRmRNA表達(dá)的影響。[結(jié)果]1淋巴細(xì)胞和A549細(xì)胞在撤除血清的無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)后IGFIRmRNA的轉(zhuǎn)錄均呈反應(yīng)性上調(diào)，至血清撤除16h后這種作用達(dá)到平臺(tái)期。血清撤除刺激可以上調(diào)淋巴細(xì)胞IGF—IRmRNA的轉(zhuǎn)錄至4倍于基礎(chǔ)水平，而對(duì)于A549細(xì)胞，這種作用可以使其IGFIRmRNA升高至2倍于其基礎(chǔ)水平。2rIGFI的作用迅速，20ng／ml的rIGFI作用8h后即可以下調(diào)淋巴細(xì)胞IGFIRmRNA至接近