豬細(xì)小病毒1型VP2蛋白與豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白共表達(dá)產(chǎn)物免疫原性鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是臨床中誘發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，常與豬細(xì)小病毒1型(PPV1)發(fā)生混合感染而導(dǎo)致更為嚴(yán)重的PMWS臨床癥狀和組織病理?yè)p傷，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)關(guān)于PCV2與PPV1混合感染的報(bào)道較多，引起了廣泛關(guān)注。通過(guò)對(duì)臨床中PPV1、新型豬細(xì)小病毒(PPV2、PPV3、PPV4)與PCV2的混合感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)其流行毒株進(jìn)行了遺傳變異分析，為我國(guó)PPVs和

2、PCV2的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。鑒于我國(guó)豬群中二者存在混合感染現(xiàn)象，因而開(kāi)發(fā)針對(duì)PCV2和PPV1的二聯(lián)亞單位疫苗具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白分別是PCV2和PPV1的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是亞單位疫苗制備的重要候選抗原。本研究以桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)PPV1-VP2蛋白制備單克隆抗體，為亞單位疫苗制備中VP2蛋白的表達(dá)提供檢測(cè)手段;采用桿狀病毒雙表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)PPV1-V

3、P2蛋白與PCV2-Cap蛋白，經(jīng)動(dòng)物免疫試驗(yàn)鑒定其免疫原性，為亞單位疫苗的研制提供了技術(shù)支撐。
　　為了解新型豬細(xì)小病毒(PPV2、PPV3和PPV4)與PMWS發(fā)生之間的關(guān)系，本研究對(duì)疑似PCVAD病料進(jìn)行了PPV1、PPV2、PPV3、PPV4與PCV2的混合感染調(diào)查及分子流行病學(xué)分析，為PMWS的致病機(jī)理的研究提供新的思路。流行病學(xué)調(diào)查表明，PPVs與PCV2單獨(dú)感染陽(yáng)性檢測(cè)率分別為:5.56％(PPV1)、39.56％(

4、PPV2)、45.11％(PPV3)、21.56％(PPV4)和47.33％(PCV2);PPVs與PCV2的混合感染陽(yáng)性檢測(cè)率分別為:4％(PPV1+PCV2)、22.44％(PPV2+PCV2)、24％(PPV3+PCV2)和12％(PPV4+PCV2)。選取其中PPVs和PCV2陽(yáng)性樣品對(duì)病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析與氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果表明，PPVs與PCV2在遺傳進(jìn)化上主要形成2大分支;通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析找到

5、了一些可能影響PPVs與PCV2遺傳進(jìn)化的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。鑒于新型PPVs與PCV2混合感染情況較為嚴(yán)重，因而推測(cè)二者在PMWS的發(fā)生中起到了相互促進(jìn)作用，這為PMWS疾病模型的研究提供一定線索。
　　為了建立PPV1抗原檢測(cè)方法，以重組桿狀病毒表達(dá)PPV1-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，融合后采用IPMA方法篩選獲得了8株針對(duì)PPV1-VP2蛋白的單克隆抗體。結(jié)果表明，所制備的單抗均可與PPV1感染的ST細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)且可以與

6、自然PPV1-VP2蛋白產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。為了鑒定這些單抗所針對(duì)的抗原表位，我們將PPV1-VP2蛋白依次進(jìn)行了分段截短表達(dá)與兩端截短表達(dá)，并通過(guò)間接ELISA的方法來(lái)掃描多肽與單抗的反應(yīng)特性，從而確定單抗表位的最短核心序列。結(jié)果表明，這8株單抗總共針對(duì)3個(gè)VP2表位，分別為B5-E1(228QQITDA233)、B10-E2(284RSLGLPpK291)與B15-E3(344FEYSNGGPFLTPI356)。PPV1-VP2氨基

7、酸序列比對(duì)結(jié)果表明，B10-E2與B15-E3在29條比對(duì)序列中完全保守，而B(niǎo)5-E1在233位氨基酸發(fā)生堿基替換。以其中1株單抗(8E4)作為檢測(cè)抗體，通過(guò)間接ELISA方法，對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)的PPV1-VP2蛋白產(chǎn)物進(jìn)行的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)表明，重組桿狀病毒感染后72 h蛋白表達(dá)量最高:利用單抗8E4對(duì)PPV1感染細(xì)胞規(guī)律的測(cè)定結(jié)果顯示，接種后16h可以檢測(cè)到病毒感染的陽(yáng)性細(xì)胞;以8E4為檢測(cè)抗體對(duì)PPV1-VP2蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行觀察

8、，結(jié)果顯示，感染后24 h病毒顆粒組裝完成并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。本研究成功制備了針對(duì)PPV1-VP2蛋白的單克隆抗體，鑒定了其表位核心序列，并建立了針對(duì)VP2蛋白抗原及病毒繁殖規(guī)律的檢測(cè)方法，為亞單位疫苗的研制及PPV1感染機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為了驗(yàn)證共表達(dá)PPV1-VP2與PCV2-Cap蛋白的免疫原性，以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)PPV1-VP2和PCV2-Cap蛋白并以各自的單表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照。SDS-PAGE和Western

9、blot鑒定結(jié)果顯示，PPV1-VP2蛋白與PCV2-Cap蛋白均得到表達(dá)，且與PPV1和PCV2的抗體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。用共表達(dá)PPV1-VP2與PCV2-Cap蛋白及及各自單表達(dá)蛋白制備4種亞單位疫苗:PPV1-VP2/PCV2-Cap共表達(dá)疫苗組、PCV2-Cap+PPV1-VP2單苗混合組、PPV1-VP2單苗組、PCV2-Cap單苗組，經(jīng)肌肉注射途徑分別免疫BALB/c小鼠和豚鼠測(cè)定免疫動(dòng)物血清抗體鑒定它們的免疫原性，同設(shè)商

10、品化PCV2滅活苗和PPV1滅活苗陽(yáng)性對(duì)照組及PBS陰性對(duì)照組。對(duì)4種亞單位疫苗免疫小鼠血清抗體測(cè)定結(jié)果顯示，PPV1抗體效價(jià)平均值均可達(dá)到1∶3200;PCV2抗體效價(jià)分別為1∶3200、1∶12800與1∶12800。豚鼠免疫試驗(yàn)血清中PPV1抗體效價(jià)平均值分別為1∶1600、1∶800與1∶800; PCV2特異性抗體效價(jià)平均值分別為1∶3200、1∶6400與1∶6400。本研究證實(shí)共表達(dá)PPV1-VP2/PCV2-Cap疫苗免