鵝細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫原性初探.pdf

1、小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的雛鵝急性敗血性傳染病。病鵝的臨診特點(diǎn)是精神委頓、食欲廢絕、嚴(yán)重下痢、有時會出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。當(dāng)前尚無治療該病的特效藥物，主要通過對開產(chǎn)前種鵝與雛鵝使用傳統(tǒng)疫苗及高免血清進(jìn)行預(yù)防。我國是全世界最大的水禽養(yǎng)殖國家，隨著人民生活水平不斷提高，對禽類肉蛋的需求不斷增加，加上本病傳播快、感染性強(qiáng)、致死率高、每年都有不同程度的流行，嚴(yán)重危害了養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，這要求我們應(yīng)該深入了解該病毒

2、的分子生物學(xué)特征及致病機(jī)制。本研究的主要內(nèi)容有以下幾點(diǎn):
　　1.將GPV的三個衣殼蛋白分別連接到真核表達(dá)載體上，構(gòu)建出pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP3重組質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將這三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞系和原代鵝胚成纖維細(xì)胞系（Goose embryo fibroblast，GEF），采用western blot的方法檢測目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，重組VP1、VP2和VP3蛋

3、白能分別與抗his標(biāo)簽抗體和抗GPV多抗血清在蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)80 kDa、70 kDa和60 kDa附近發(fā)生特異性結(jié)合。說明這三種重組質(zhì)粒能在同源及異源細(xì)胞中有效表達(dá)，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　2.利用GEF和鵝外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)為模型比較三種衣殼蛋白的細(xì)胞免疫原性。本研究將VPs的三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GEF，60 h后收獲細(xì)胞并提取總RNA，以實時熒

4、光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)的方法檢測IL-6和IL-1β、IFNs的轉(zhuǎn)錄水平。基于此，將GEF表達(dá)的VPs用于處理PBMCs，共孵育6h，收集細(xì)胞抽提RNA檢測CD4、CD8α、IL-6、IL-1β和IFNs的表達(dá)情況。還將GEF中表達(dá)的VP2經(jīng)超離純化、磷鎢酸負(fù)染色后在透射電鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP2和VP3在GEF和PBMCs中都可顯著上調(diào)IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)量。在PBMCs模型中，VP1

5、誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子與實驗對照相比無明顯差異;而VP2還可顯著上調(diào)IFNγ和IFNλ的量;VP3處理組的CD8α表達(dá)量顯著高于VP1和VP2處理組。以上結(jié)果說明VP2和VP3的細(xì)胞免疫原性要優(yōu)于VP1，且VP2在GEF中表達(dá)可形成病毒樣顆粒。
　　3.基于我們前期研究結(jié)果，VP2被挑選出作為DNA疫苗候選基因，再聯(lián)合不同佐劑共同以肌肉途徑免疫雛鵝，分別在免疫0d、7d、14d、21 d、28 d的時間點(diǎn)采集血液樣品，采用RT-PCR

6、和間接ELISA的方法分別檢測被免疫雛鵝血液中CD4、CD8α、IL-1β、IL-18、IFNs等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化，以及血清中特異性GPV IgY抗體水平，最后對幾種免疫佐劑的免疫效果進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，在免疫后的28 d內(nèi)，CD4和CD8α的表達(dá)水平整體呈上升趨勢;在免疫后第7d和第14 d，pcDNA3.1-VP2免疫組鵝血液中CD8α的表達(dá)水平顯著上升;pcDNA3.1-VP2組也在第7d顯著上調(diào)了IFNλ的表達(dá);此外，

7、pcDNA3.1-VP2與ODN2006佐劑聯(lián)合免疫組分別在第7d和第21d顯著上調(diào)了IL-1β和IL-18的表達(dá)。血清中特異性IgY抗體檢測結(jié)果顯示:除對照組外的三組實驗組在免疫后14 d開始抗體增加，并隨著時間增加而升高，至28 d時，抗體水平達(dá)到最高;pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP2+MPLA、pcDNA3.1-VP2+ODN2006免疫組的抗體水平均顯著高于陰性對照組，但是不同佐劑組之間無差異。此外，在第21